Princip Počítání leukocytů během mikroskopie v určitém počtu čtverců počítací komory a výpočet jejich počtu v 1 litru krve, s přihlédnutím k ředění krve a objemu počítací komory.
Činidlo: 3-5% roztok kyseliny octové, zbarvený pro barvení jader leukocytů několika kapkami roztoku methylenové modři. Roztok má modrou barvu, může být skladován po dlouhou dobu.
Průběh odhodlání. V suché zkumavce nalijte 0,4 ml roztoku kyseliny octové. Z prstu se odebere 0,02 ml krve (můžete použít antikoagulačně stabilizovanou žilní krev). Otřete špičku pipety, pak z ní vyfoukejte krev na dno zkumavky, promíchejte, znovu vytřepejte a vyfoukněte směs krve a činidla (pipetování). Trubku označte a nechte ji počítat. Uchovávejte směs krve s roztokem kyseliny octové do 2 - 4 hodin.
Krev naředěná v zkumavce kyselinou octovou, důkladně promíchejte a naplňte ji počítací komorou. Naplněná komora se ponechá v horizontální poloze po dobu 1 minuty, aby se usadily bílé krvinky. Bez změny horizontální polohy kamery ji umístí na stůl mikroskopu a při malém zvětšení (okulár 10 ×, čočka 8 ×) spočítá bílé krvinky ve 100 velkých čtvercích, což odpovídá 1600 malým.
Pro větší přesnost jsou leukocyty počítány napříč mřížkou ve velkých čtvercích, které nejsou rozděleny na malé čtverce a proužky, počínaje levým horním rohem mřížky. Pro lepší kontrast ztmavte zorné pole, upusťte kondenzátor a zavřete clonu. Buňky umístěné uvnitř čtverce a ležící na jakýchkoli dvou řádcích se počítají, aby se nepočítaly stejné buňky dvakrát.
Výpočet počtu buněk se provádí podle vzorce:
kde X je počet leukocytů v 1 μl krve; a - počet leukocytů ve 100 velkých čtvercích; 20 - ředění krve; 100 je počet velkých čtverců; 250 je konverzní faktor na 1 μl, protože objem jednoho velkého čtverce je 1/250 μl (strana čtverce je 1/5 mm, výška je 1/10 mm).
V praxi se pro výpočet počtu leukocytů v 1 μl krve jejich počet ve 100 velkých čtvercích vynásobí 50 a v 1 litru - výsledná hodnota se vynásobí 106.
Poznámka Při počítání leukocytů je chyba nevyhnutelná v 6–8% případů.
- S velkým počtem normocytů v periferní krvi se počítají v počtu leukocytů (jak leukocytů, tak normocytů - nukleových buněk). Aby se správně stanovil počet leukocytů, měl by celkový počet nukleocytů z celkového počtu nukleových buněk odečíst počet normocytů.
- Zbývající chyby jsou podobné chybám, které vznikají při výpočtu počtu červených krvinek v počítací komoře.
Počet leukocytů
Sbírat krev v mixéru leukocytů na značku 0,5. Okamžitě přidejte do krve zřeďovací roztok kyseliny octové o koncentraci 3% na značku 11. Obsah kapiláry důkladně promíchejte a naplňte ji Goryaevovou komorou. Počítání se provádí na nejméně 100 velkých čtvercích. Jedná se o velké nelítostné čáry, které jsou seskupeny do čtyř v mřížce kamery Goryaev. Počet leukocytů v 1 l krve se vypočte podle vzorce:
L = N x 4000 x 20 x 10 6
kde: N je počet leukocytů ve sto velkých čtvercích; 4000 je násobitel, který snižuje objem malého čtverce na objem 1 μl krve; 20 - korekce stupně ředění krve; 1600 - počet leukocytů v malých čtvercích; 10 6 - počet mikrolitrů v 1 l.
Doporučení pro registraci
Na závěr porovnejte získané výsledky s normálními hodnotami.
Lab № 7.3
Stanovení množství hemoglobinu v krvi
194.48.155.245 © studopedia.ru není autorem publikovaných materiálů. Ale poskytuje možnost bezplatného použití. Existuje porušení autorských práv? Napište nám Zpětná vazba.
Zakázat adBlock!
a obnovte stránku (F5)
velmi potřebné
Počítání bílých krvinek
Leukocytóza může být absolutní (pravdivá) a relativní (redistribuční).
Absolutní leukocytóza je pozorována u akutních zánětlivých procesů, nekrózy tkání, akutních bakteriálních infekcí (s výjimkou tyfové horečky, brucelózy, tularemie atd.), Alergických stavů, maligních nádorů (s destrukcí tkání), poranění hlavy a krvácení v mozku, diabetu. uremická kóma, šok, akutní ztráta krve, jako primární reakce - s radiační nemocí. Významný nárůst počtu leukocytů se vyskytuje u leukémie.
Relativní (redistribuční) je důsledkem přijetí leukocytů v krevním oběhu z orgánů, které slouží pro její depot. Vyskytuje se po jídle (leukocytóza potravy), horkých a studených lázních, silných emocích (vegetovaskulární leukocytóza), intenzivní svalové práci (myogenní leukocytóza) atd.
Leukopenie Leukopenie je považována za indikátor inhibice funkční schopnosti kostní dřeně v důsledku expozice toxickým látkám (arsen, benzen atd.), Některým lékům (sulfanilamidy, chloramfenikol, butadion, imuno, cyklofosfamid atd.), Virům (chřipka, virová hepatitida)., spalničky atd.), mikroby (tyfus, brucelóza atd.), ionizující záření, rentgenové paprsky a hypersplenismus (zvýšená funkce sleziny).
Leukocytóza a leukopenie jsou vzácně charakterizovány proporcionálním zvýšením (poklesem) celkového počtu leukocytů všech typů (například leukocytóza se zhrubnutím krve); ve většině případů dochází k nárůstu (poklesu) počtu jakéhokoli typu buněk, proto se používají termíny „neutrofilie“, „neutropenie“, „lymfocytóza“, „lymfopenie“, „eosinofilie“, „eosinopenie“, „monocytóza“, „monocytopenie“., "Basophilia."
Při klinickém hodnocení změn v počtu leukocytů je velký význam přikládán procentuálnímu poměru jednotlivých forem leukocytů, tj. Vzorce leukocytů.
Počet leukocytů v krvi zdravého člověka:
Relativní množství Absolutní množství
Basofily ……………………….0-1% 0-0,0650 x 10 9 / l
Eosinofily …………………….0,5-5% 0,02-0,30 x 10 9 / l
Neutrofily: - myelocyty............ 0% chybí
- bodl... 1 až 6% 0,040 až 0,300 x 10 9 / l
- segmentová….47-72% 2,0-5,5 x 10 9 / l
Lymfocyty …………………………….19-37% 1,2-3,0 x 10 9 / l
Monocyty ………………………….3-11% 0,09-0,6 x 10 9 / l
Počítání leukocytů se provádí v obarvených stěrech periferní krve. Pro správnou interpretaci výsledků studia leukocytárního vzorce se doporučuje počítat v absolutních množstvích, nikoli však v relativních. Nejběžnější metody malování stěr Romanovsky-Giemsa, Pappenheim. Při ponoření se počítá nejméně 200 buněk a potom se odvozuje procentuální poměr určitých typů leukocytů. Analýza leukogramu s přihlédnutím k ostatním krevním parametrům a klinickému obrazu je cennou metodou vyšetření, pomáhá při diagnostice a stanovení prognózy onemocnění.
Hlavní příčiny neutrofilie.
Akutní bakteriální infekce - lokalizované a generalizované.
Zánět nebo nekróza tkáně.
Léčivé účinky (kortikosteroidy).
Hlavní příčiny neutropenie.
Infekce - bakteriální (tyfus, brucelóza, tularemie, paratyphoidní horečka) a virové (infekční hepatitida, spalničky, chřipka, rubeola a další).
Myelotoxické účinky a potlačení granulocytopoézy (ionizující záření; chemické látky - benzen, anilin, DDT; léčivé účinky - cytostatika a imunosupresiva; vitamín B)12-anémie z nedostatku kyseliny listové, akutní aleukemická leukémie, aplastická anémie).
Expozice protilátek (imunitní formy) - přecitlivělost na léky, autoimunitní onemocnění (SLE, revmatoidní artritida, chronická lymfatická leukémie), izoimunitní projevy (hemolytické onemocnění novorozence).
Redistribuce a depozice v orgánech - šokové stavy, nemoci se splenomegálií a hypersplenismem.
Dědičné formy (familiární benigní chronická neutropenie).
Hlavní příčiny eosinofilie.
Parazitární invaze (trichinóza).
Chronické kožní léze - lupénka, pemfigus, ekzém.
Nádory (eozinofilní varianty leukémie).
Další onemocnění - fibroplastická endokarditida Lefflera, šarlatová horečka.
Ve fázi zotavení infekcí a zánětlivých onemocnění (příznivý prognostický znak).
Příčiny eosinopenie (aneosinofilie).
Zvýšená aktivita adrenokortikosteroidů v těle.
Hlavní příčiny bazofilie:
Chronická myeloidní leukémie a erytrémie.
Hlavní příčiny monocytózy.
Subakutní a chronické bakteriální infekce.
Parazitární infekce - leishmanióza, malárie.
Hemoblastóza - monocytová leukémie, lymfogranulomatóza, lymfomy.
Dalšími podmínkami jsou SLE, sarkoidóza, revmatoidní artritida, infekční monocytóza; v období zotavení z infekcí, při opuštění agranulocytózy, po splenektomii.
Snížení počtu monocytů je důležité zejména při hodnocení poměru lymfocytů a monocytů u plicní tuberkulózy.
Hlavní příčiny lymfocytózy.
Infekce - akutní virová (infekční mononukleóza, spalničky, rubeola, neštovice), chronická bakteriální (tuberkulóza, syfilis, brucelóza), protozoální (toxoplazmóza).
Hemoblastóza (lymfocytární leukémie, lymfom).
Další nemoci - hypertyreóza, Addisonova choroba, vitamin B12-anémie z nedostatku folikulu, hypo- a aplastická anémie.
Lymfocytopenie je pozorována u SLE, Hodgkinovy choroby, rozšířené tuberkulózy lymfatických uzlin, v terminálním stadiu selhání ledvin, akutní radiační nemoci, stavů imunodeficience, při užívání glukokortikoidů.
Zvýšení nebo snížení počtu určitých typů leukocytů v krvi může být relativní nebo absolutní. Pokud se jedná pouze o procento určitého typu změn bílých krvinek, pak dochází k relativní neutrofilii, relativní eozinopenii atd. Zvýšení nebo snížení absolutního obsahu jakéhokoliv typu leukocytů, tj. Počtu těchto buněk na jednotku objemu krve, se nazývá absolutní neutrofilie, absolutní eozinopenie atd.
Posunutí vzorce doleva (zvýšení počtu mladých forem neutrofilů) je známkou zánětu nebo nekrotického procesu v těle.
Posun vzorce leukocytů doprava je charakteristický pro radiační nemoc a vitamin B12-anémie z nedostatku kyseliny listové.
Absence nebo významné snížení počtu všech typů granulovaných leukocytů - granulocytů (neutrofilů, eozinofilů, bazofilů) je označováno termínem agranulocytóza. V závislosti na mechanismu výskytu se rozlišují myelotoxika (účinky ionizujícího záření, cytostatický příjem) a imunita (hapten a autoimunitní agranulocytóza).
Počet leukocytů
Metoda počítání ve fotoaparátu. Odběr a ředění krve vyrobené metodou zkumavky. Do zkumavky se zavede 0,4 ml zřeďovací kapaliny a 0,02 ml kapilární krve (s výhodou Vidalevskaya). Výsledné ředění je prakticky považováno za 1:20 3. Jako ředidlo se obvykle používá 3 - 5% roztok kyseliny octové, tónovaný methylenovou modří, jako ředidlo (kyselina octová lyzuje erytrocyty, methylenová modř barví jádra leukocytů). Před naplněním komory se Goryaeva trubice se zředěnou krví důkladně protřepe. Komora se plní stejným způsobem jako při počítání červených krvinek.
Leukocyty jsou mnohem menší než erytrocyty (1–2 na velký čtverec), proto jsou pro přesnost počítány ve 100 velkých čtvercích (netříděných). Výpočet: 100 velkých čtverců (1600 malých) se spočítá jako leukocyt.
Při zapamatování, že objem malého čtverce je 1/4000 mm3 a krev je 20krát zředěna, je počet leukocytů v 1 μl krve vypočítán: 4000 20 a děleno 1600 = a x 1/2. Pro získání skutečného obsahu leukocytů v 1 μl krve stačí prakticky rozdělit na polovinu počet získaný ve výpočtu a přidat 2 nuly. Průměrná chyba metody je ± 7%.
Přesnější (2-3% chyba) a perfektní je počet leukocytů pomocí elektronických zařízení. Počítání leukocytů v počítačích částic se provádí podle stejného principu jako erytrocyty. Předběžná krev se zředí a smísí s jakýmkoliv činidlem, které rozkládá červené krvinky. V automatickém analyzátoru „Technicon“ se používá roztok kyseliny octové jako takový, v přístrojích „Culter“ a „Celloskop“ - saponin nebo sapoglobin, které se přidají naředěné (1: 500, 1: 700) v isotonickém roztoku chloridu sodného (6 kapek na 20 ml). šlechtění).
Počítání krevních leukocytů se provádí v barvených periferních krevních stěrech.
Je lepší počítat v nejtenčím místě poblíž konce stěrky, nejméně 200 buněk (s výjimkou výrazné leukopenie), a pak odvodit procentuální poměr určitých typů bílých krvinek. Počítání se doporučuje ve stejném pořadí: polovina buněk by se měla počítat nahoře, napůl na konci úderu, aniž by šla na samotný okraj a střed, cikcak (3-4 pole pohledu podél tahu, 3-4 pole v pravém úhlu ke středu tahu, pak 3-4 pole na stranu rovnoběžnou s hranou, opět v pravém úhlu nahoru a tak dále na jednu stranu).
Příprava nátěrů. Pečlivě umyté a odtučněné sklo (jeho okraj) se dotýká kapky krve v místě vpichu injekce. Skvrnu tvoří brusné sklo tak, že je pod úhlem 45 ° k skluzu před kapkou. Poté, co do této kapky přinesli sklenici, čekají, až se krev rozšíří podél jejího okraje, a rychle rychlým pohybem provádějí brousicí sklo dopředu, aniž by ho odnášeli od předmětu předtím, než vyschne celou kapku.
Správně zhotovený nátěr má nažloutlou barvu (tenkou), nedosahuje okrajů skla a končí stopou (knírkem).
Barvení suchých nátěrů po předběžné fixaci. Nejlepší fixace se dosáhne v absolutním methylenalkoholu (3-5 minut) nebo ve směsi Nikiforova o stejných podílech absolutního ethanolu a etheru (30 minut).
Mezi hlavní hematologické barvy patří methylenová modř a její derivát - azurový I (methylen azurový) a azurový II (směs stejných částí azurové I a methylenové modři) až kyselý eozin rozpustný ve vodě.
● Malování Romanovským-Giemsou. Barva Romanovsky-Giemsa (z výroby) má následující složení: Azur II - 3 g, ve vodě rozpustný žlutý eosin - 0,8 g, methylalkohol - 250 ml a glycerin - 250 ml. Pracovní nátěrový roztok se připraví rychlostí 1,5-2 kapek hotové barvy na 1 ml destilované vody. Barva se nalije na nátěr s pravděpodobně vyšší vrstvou; doba barvení - 30-35 minut Po této době se tampony promyjí vodou a suší na vzduchu. Tímto způsobem může být jádro dobře diferencované, ale neutrofilní granularita cytoplazmy je mnohem horší, takže je široce používána pro barvení periferního krevního nátěru.
● Kombinované barvení May-Grunwald-Romanovsky-Giemsa podle Pappenheima. Hotové barvivo, fixační přípravek May-Grunwald, který je roztokem eosinmethylenové modři v methylenalkoholu, se pipetuje na fixovaný nátěr po dobu 3 minut. Po 3 minutách se do barvy, která pokrývá roztok, přidá stejné množství destilované vody a zbarvení pokračuje další 1 minutu. Poté se barva vymyje a nátěr se vysuší na vzduchu. Poté se vysušený nátěr znovu natírá čerstvě připraveným vodným roztokem Romanovského barvy po dobu 8-15 minut. Tato metoda je považována za nejlepší, zejména u nátěrů punkcí kostní dřeně.
Zvýšení počtu leukocytů v periferní krvi nad normální hladinu se nazývá leukocytóza, pokles se nazývá leukopenie. Leukocytóza (leukopenie) je vzácně charakterizována proporcionálním zvýšením (poklesem) počtu leukocytů všeho druhu, například leukocytózou se zhrubnutím krve. Ve většině případů dochází ke zvýšení počtu (snížení) jednoho typu buňky. Zvýšení nebo snížení počtu jednotlivých typů leukocytů v krvi může být relativní nebo absolutní, v závislosti na celkovém počtu leukocytů - normální, zvýšené nebo snížené. Změna počtu, poměru jednotlivých forem a morfologie leukocytů závisí na typu a virulence patogenu, povaze, průběhu a rozsahu patologického procesu, individuální reakci organismu.
Leukocyty (leukocytus)
Leukocyty. Kvantitativní stanovení leukocytů. Počítání leukocytů pomocí kamery Goryaeva. Kvantitativní obsah leukocytů. Leukocytóza.
Bílé krvinky
Počet leukocytů v krvi závisí jak na rychlosti jejich tvorby, tak na jejich mobilizaci z kostní dřeně, jakož i na jejich využití a migraci do tkání (na léze), zachycení plic a sleziny. Tyto procesy jsou zase ovlivňovány řadou fyziologických faktorů, a proto počet leukocytů v krvi zdravého člověka podléhá výkyvům: stoupá do konce dne, během fyzické námahy, emočního stresu, příjmu potravy bílkovin a prudkých změn teploty okolí.
Kvantitativní stanovení leukocytů
Leukocyty se počítají pomocí kamery Goryaev a pomocí automatických čítačů.
Počítání leukocytů pomocí kamery Goryaeva
In vitro metodou odběru krve do počtu leukocytů:
- Do zkumavky se nalije 0,4 ml 3 až 5% roztoku kyseliny octové s methylenovou modří. Použijte kapilární pipetu k odebrání 20 μl krve z čerstvé kapky (ředění 20krát), opatrně vyfoukněte do zkumavky s činidlem a propláchněte pipetu. Dobře promíchejte;
- čisté a suché krycí sklo se vtírá do komory tak, aby se v místě dotyku vytvořily duhové prstence;
- krev zředěná v zkumavce, dobře promíchejte. Konec kulaté skleněné tyčinky vezme kapku krve a přivede ji na okraj leštěného skla komory;
- po naplnění komory se nechá 1 min v klidu pro sedimentaci leukocytů;
- Leukocyty jsou zvažovány u nízkého zvětšení (cíl × 8 nebo × 9, okulár × 10 nebo × 15) s tmavým zorným polem (se sníženým kondenzátorem nebo zúženou bránicí);
- pro uspokojivé výsledky jsou leukocyty počítány ve 100 velkých čtvercích.
Znáte-li objem velkého čtverce a stupeň ředění krve, zjistěte počet leukocytů v 1 μl a 1 l krve. Strana velkého čtverce je 1/5 mm, plocha je 1/25 mm2, objem prostoru nad tímto čtvercem je 1/250 mm3.
Vzorec pro počítání bílých krvinek:
kde B je počet leukocytů ve 100 velkých čtvercích;
P - stupeň ředění (20).
Počet leukocytů
Norma: 4,0–9,0 × 10 9 / L
Zvýšení počtu leukocytů nad 9,0 × 10 9 / l se nazývá
leukocytóza, pokles jejich počtu pod 4,0 × 10 9 / l - leukopenie. Normálně však může být i 3,5 × 109 v 1 l leukocytů u řady jedinců. Podle literatury tito lidé mají zvýšenou imunitní odolnost a je méně pravděpodobné, že onemocní, což se zdá být způsobeno potřebou imunitní odpovědi, která má rezervu leukocytů ve tkáních, kde je 50–60krát více než v krevním řečišti. Je zřejmé, že u zdravých jedinců s nízkým počtem bílých krvinek v periferní krvi se jejich zásoby v tkáních odpovídajícím způsobem zvyšují. Tento jev je vysvětlen dědičným a rodinným charakterem nebo zvýšením vlivu parasympatického nervového systému.
Leukopenie může být funkční a organické.
Funkční leukopenie je spojena s dysregulací tvorby krve a je pozorována:
- s některými bakteriálními a virovými infekcemi (tyfová horečka, chřipka, neštovice, rubeola, Botkinova choroba, spalničky);
- působením léků (sulfonamidy, analgetika, antikonvulziva, antithroidní, cytostatická a jiná léčiva);
- během svalové práce, zavedení cizích proteinů, nervových a teplotních efektů, hladovění, hypotonických stavů;
- falešná leukocytopenie může být spojena s agregací leukocytů během dlouhodobého skladování krve při pokojové teplotě (více než 4 hodiny).
Organická leukopenie vyplývající z aplazie kostní dřeně a její nahrazení tukovou tkání nastává, když:
- aplastickou anémii;
- agranulocytóza;
- leukopenickou leukémii;
- některé formy Hodgkinovy choroby;
- ionizující záření;
- hypersplenismus (primární a sekundární);
- onemocnění kolagenu.
Leukocytóza
Leukocytóza je reakce hematopoetického systému na účinky
exogenní a endogenní faktory. Existují fyziologické a patologické leukocytózy.
Fyziologická leukocytóza je:
- zažívací - po jídle, zejména s vysokým obsahem bílkovin; počet leukocytů nepřekračuje 10,0–12,0 × 10 9 / l a po 3–4 hodinách se vrátí do normálu;
- s emocionálním stresem (adrenalin), těžkou fyzickou námahou, ochlazením, nadměrným slunečním zářením (spálení sluncem), podáním řady hormonů (katecholaminů, glukokortikosteroidů atd.), ve druhé polovině těhotenství, během menstruace a v důsledku nerovnoměrné distribuce leukocytů v krvi hlavního proudu.
Patologická leukocytóza je rozdělena na absolutní a relativní.
Absolutní leukocytóza - zvýšení počtu leukocytů v krvi až na několik set tisíc (100,0–600,0 × 10 9 / l a více).
- Nejčastěji pozorované u leukémie: u chronické leukémie - v 98-100% případů, s akutní leukémií - v 50-60%. Změna poměru leukocytových buněk v kostní dřeni a vpichu krve je základem pro diagnostiku leukémie.
Je pozorována relativní leukocytóza:
- akutní zánětlivé a infekční procesy, s výjimkou tyfové horečky, chřipky, neštovic, rubeoly, Botkinovy choroby, spalniček. Největší leukocytóza (až 70,0–80,0 × 10 9 / l) je pozorována při sepse;
- pod vlivem toxických látek (hmyzí jedy, endotoxiny), ionizujícího záření (bezprostředně po ozáření);
- v důsledku působení kortikosteroidů, adrenalinu, histaminu, acetylcholinu a preparátů digitalisu;
- s tkáňovou dezintegrací (nekrózou), infarktem myokardu, trombózou periferních tepen s rozvojem gangrény, popáleninami, exsudativní pohrudnice, perikarditidou, urémií, jaterní kómou;
- významná ztráta krve při poranění, vnitřní, gynekologické a jiné krvácení.
Nárůst počtu leukocytů u infekčních onemocnění je ve většině případů doprovázen posunem vzorce leukocytů doleva.
Počítání počtu leukocytů a destiček
Faktory ovlivňující správnost studia bílých krvinek
- dlouhodobé skladování krve při pokojové teplotě
Normy počtu bílých krvinek
Věk Počet leukocytů
- 1 den 11,6 - 22,0
- 1 týden 8.1.- 14.3
- 1 měsíc 7,6 - 12,4
- Dospělí 4,0 - 9,0
Metody stanovení počtu leukocytů v krvi.
- Počítání počtu leukocytů v počítací komoře
- Počítání leukocytů v hematologických analyzátorech
Stanovení počtu leukocytů v počítací komoře.
- Počítání leukocytů pod mikroskopem se provádí po lýze červených krvinek ve 100 velkých čtvercích počítané mřížky a přepočítá se na 1 litr krve na základě objemu čtverců a ředění krve. Počet leukocytů by měl být proveden během 2-4 hodin po odběru krve.
- Jsou-li v periferní krvi nukleované červené krvinky, nejsou lyzovány a spočítány společně s leukocyty. V tomto případě se pro stanovení skutečného počtu leukocytů odečte počet buněk v červené řadě od celkového počtu buněk.
- Například: Celkový počet leukocytů ve výpočtu v komoře (nebo analyzátoru) -45x109 / l. Při výpočtu vzorce leukocytů bylo zjištěno, že na 100 leukocytů je přítomno 50 erytroblastů (normoblastů).
Vypočítáme skutečný počet leukocytů v krvi:
150 buněk - 45 x 109 / l
100 buněk (leukocyty) - X
X = 100 * 45 * 10 / l / 150 = 30 x 10 / l
Skutečný počet leukocytů v krvi je tedy 30 x 109 / l.
Hlavní zdroje chyb při výpočtu leukocytů v komoře:
- Nesprávný poměr objemu krve a kyseliny octové odebrané ve zkumavce.
- Nesprávně připravený roztok kyseliny octové (v koncentraci vyšší než 5%, některé leukocyty mohou lyse, což povede k podhodnocení výsledku).
- Dlouhodobé vystavení vzorku při teplotách nad 28 ° C, které může urychlit lýzu leukocytů ve vzorku a vést k podhodnocení výsledku.
- Nesprávné naplnění komory Goryaev. Stejně jako při výpočtu červených krvinek musí být fotoaparát ponechán po dobu 1 minuty, aby se buňky usadily.
- Fotoaparát Goryaev nebyl po předchozí definici dostatečně umyt. Leukocyty, které zůstaly v komoře, mohou přehodnotit výsledky analýzy.
Metody počítání krevních destiček
- v počítací komoře
Každá skupina metod má své výhody i nevýhody.
- Počítání krevních destiček v komoře je dostatečně přesné, nevyžaduje výpočet počtu červených krvinek. Na druhou stranu je tato metoda pracnější, protože destičky v nativní formě jsou reprezentovány malými a špatně kontrastními prvky. Nevýhodou tohoto způsobu je počítání krevních destiček v následujících hodinách po odběru krve.
- Stanovení počtu krevních destiček v krevních nátěrech je podstatně nižší v přesnosti k komorové metodě nebo automatickým čítačům. Chyby při počítání krevních nátěrů mohou být způsobeny špatnou kvalitou nátěru a souvisejícím nerovnoměrným rozložením krevních destiček, nepřesným stanovením počtu červených krvinek. Významnou nevýhodou tohoto způsobu je nutnost současného počítání krevních destiček a červených krvinek v krvi. Výhodou je schopnost studovat krevní destičky kdykoliv, bez ohledu na dobu odběru krve.
- Metoda stanovení destiček pomocí hematologického analyzátoru umožňuje přesně určit počet destiček, jejich průměrný objem a distribuci podle objemu.
Počet leukocytů
Počet leukocytů se vypočítá pomocí automatického čítače nebo v Goryaevově komoře. Pro spočítání leukocytů v komoře se připraví Turkova kapalina - roztok kyseliny octové s vodním roztokem methylenové modři (0,1 ml 0,1% roztoku methylenové modři se přidá do 9 ml 10% kyseliny octové). Do zkumavky se nalije 0,4 ml tekutého Türku. Načtěte přesně 0,02 ml krve, opatrně přidejte do ředicí kapaliny. Ředění krve je 1:20. Dobře se promíchá a nechá se stát 4 minuty. Naplňte komoru Goryaeva po pečlivém protřepání zkumavky se zředěnou krví. Kamera se ponechá 1 min na rovném povrchu pro sedimentaci leukocytů. Potom se leukocyty spočítají při nízkém zvětšení mikroskopu (čočka 8, okulár 10 nebo 15) se ztmaveným zorným polem (se sníženým kondenzátorem nebo zúženou membránou). Leukocyty jsou považovány za 100 nezveřejněných velkých čtverců, což odpovídá 1600 malým. Výsledky počítání buněk ve velkých čtvercích shrnují a vypočítávají jejich počet v 1 μl krve podle vzorce:
kde X je počet leukocytů v 1 μl krve; A - počet buněk počítaných ve 100 velkých čtvercích, 1600 - počet malých čtverců; 20 - ředění krve; 4000 je násobitel, jehož výsledkem je objem 1 μl krve na základě objemu malého čtverečku (1/4000 μl).
Počítání leukocytárního vzorce Vyšetříme barvené periferní krevní nátěry. Nezbytnou podmínkou pro správné zvážení morfologických znaků krevních buněk je řádně zhotovený a dobře zbarvený krevní nátěr. Krémový nátěr se připravuje na suchých, čistých, dobře odmaštěných diapozitivech, stárnou ve směsi Nikiforov (ethylalkohol 96 ° C a diethylether 1: 1). Pokud si vezmete skleněné sklíčko pro dlouhé okraje, dotkněte se jeho povrchu kapkou krve (ale ne kůží) uvolněnou z propíchnutí nebo kapkou krve s mikropipetou nebo kapilárou. Skleněná skluzavka je držena na stole nebo v levé ruce pro úzké hrany. Pravou rukou aplikujte broušené sklo s úzkým okrajem na sklo krví vlevo od kapky pod úhlem 45 ° a zatlačte jej doprava, dokud se nedotkne krve. Čekají, až se krev rozšíří po celém okraji broušeného skla, a pak rychlým a rychlým pohybem jej zavede zprava doleva, dokud se celá kapka nevyčerpá. Kapka krve by měla být malá a rozdělená tak, aby celý nátěr byl položen na sklenici, aniž by před svým okrajem dosáhl 1-1,5 cm. Dobře vyrobený stěr je tenký, má nažloutlou barvu a končí v "koštěti". Vzduchem sušené krevní nátěry jsou umístěny do speciálních misek pro fixaci nebo do běžných skleněných sklenic naplněných fixační kapalinou (methylalkohol, doba fixace 3-5 minut, ethylalkohol, 30 minut; směs Nikiforov, 20-30 minut). Fixované přípravky se suší ve vzduchu a potom se obarví barvivem Romanovsky-Giemsa. Hotový nátěrový roztok Romanovsky-Giemsa (azureosin) zředěný 1:10 v požadovaném objemu pro barvení. Pevný nátěr se nalije zředěnou barvou, která se nalije na nátěr s vyšší vrstvou. Zbarvení trvá v závislosti na teplotě vzduchu v místnosti od 25 do 45 minut. Po dokončení nátěru opláchněte nátěr destilovanou vodou a dejte tahy svisle do dřevěného stojanu pro sušení. Mikroskopie krevních nátěrů se provádí ponořením při zvětšení 100 x 10. Počítání leukocytů se provádí podél klikaté čáry („Meanderova linie“), počítá se 100-200 buněk, přičemž se bere v úvahu počet jednotlivých forem leukocytů: neutrofily bodné a segmentované, eosinofily, bazofily, monocyty, lymfocyty. Vypočítejte procento každého typu buněk.
Počítání absolutního počtu fagocytů a lymfocytů Absolutní počet fagocytů (neutrofilů a monocytů) a lymfocytů vyšších obratlovců se vypočítá na základě údajů o počtu leukocytů v periferní krvi a vzorci leukocytů.
Test fagocytární funkce
Stanovení fagocytového indexu a fagocytového čísla
Bylo vyvinuto velké množství technik pro hodnocení absorpce a trávicí aktivity leukocytů. Všechny jsou založeny na schopnosti fagocytů absorbovat cizí částice, které tvoří testovací systém (specifický typ mikroorganismu, zymosan, latex - objekt absorpce). Zjevení se provádí in vitro nebo in vivo. Obecný průběh stanovení je následující: Heparinizovaná nebo citrátová čerstvá krev (nebo suspenze fagocytů) se smísí se stejným objemem suspendované denní mikrobiální suspenze (Saccharomyces cerevisiae, Staphilococcus aureus, S. albus, E.coli, A. nydrophila) nebo jiného absorpčního objektu. Směs se jemně promíchá a umístí se do termostatu (37-40ºС - pro teplokrevné v závislosti na normální teplotě těla, 26 ° C - pro ryby milující teplo a nižší pro chladící milence). Po 15, 30, 45, 60 a 90 minutách se na sklíčkach připraví nátěry, suší se, fixují se methylalkoholem nebo směsí Nikiforov a obarví se podle Romanovského-Giemsa. Dívají se na šmouhy pod ponorem a určují fagocytární aktivitu - procento fagocytů podílejících se na fagocytóze, fagocytární index - počet testovaných mikrobů zachycených jedním fagocytárním leukocytem, počet fagocytů - průměrný počet fagocytárních objektů na 1 aktivní neutrofil. Vyhodnocení ukazatelů v různých časových intervalech nám umožňuje odhadnout dynamiku fagocytózy. Za normálních okolností by měl být po 90 minutách fagocytární index nižší než po 45 minutách a 60 minutách v důsledku štěpení mikrobů. V případě porušení trávení se nemění.
Posouzení funkční aktivity fagocytů redukční reakcí nitro-modrého tetrazolu (NBT-test)
Tento test je indikátorem baktericidní funkce fagocytů a umožňuje vyhodnotit jejich schopnost zabíjení závislé na kyslíku. Když je tento mechanismus zabíjení aktivován, aktivuje se enzym NADPH oxidasa, což vede k výskytu reaktivních forem kyslíku ve fagocytech. Uvolňování těchto látek v buňce se nazývá kyslíková (respirační) exploze, kterou lze registrovat pomocí testu NBT. Při formulaci tohoto testu se do fagocytů přidává látka nitrosinium tetrazolium, která je buňkou absorbována a v přítomnosti reaktivních forem kyslíku se mění na tmavě modrou látku, diformazan. Čím více tmavě modrých granulí je fixováno na povrchu nebo uvnitř fagocytů, tím více se tvoří aktivní formy kyslíku, tím více je zabíjení závislé na kyslíku.
Test NBT je nastaven ve dvou verzích: spontánní a indukovaná. Při nastavování spontánního NBT-testu se fagocyty kultivují v přítomnosti NST bez předběžné aktivace buněk, při provádění indukovaného NBT-testu se do kultivačního média přidá aktivátor fagocytové reakce. Nastavení NBT testu ve dvou variantách umožňuje výpočet funkční rezervy buněk, což je rozdíl mezi počtem (intenzitou) indukovaných buněk pozitivních na diformazan a počtem (intenzitou) spontánních buněk pozitivních na diformazan. Hodnoty indukovaného NBT testu charakterizují aktivitu fagocytárních buněk v přítomnosti antigenního stimulu a jsou považovány za kritérium jejich připravenosti k úplné fagocytóze. Spontánní NBT test umožňuje odhadnout stupeň aktivace mechanismů zabíjení neaktivovaných fagocytů závislých na kyslíku. Charakterizuje stupeň aktivace intracelulárních mikrobicidních systémů.
K vytvoření spontánního NBT testu se přidá 0,05 ml 0,2% roztoku NBT v pufru fosforečnanu draselného (0,1, pH 7,3) a 0,05 ml stejného pufru k 0,1 ml krve. Souběžně se umístí vzorek, aby se zohlednil indukovaný test NBT, ve kterém se místo 0,05 ml pufru přidává stejný objem aktivátoru fagocytů (například pyrogenní v koncentraci 50 μg / ml). Reakční směs se termostatuje ve vodní lázni při teplotě 37 ° C (30 až 60 minut). Připraví se nátěry se střední hustotou, suší se na vzduchu a fixují se v ethylalkoholu nebo směsi Nikiforov (20 min), poté se natřou vodným roztokem neutrální červené (0,1%, 1 min).
Po reakci jsou krevní stěrky pod mikroskopem ponořeny (100 × čočka, 10 × okulár). Mezi 100 buňkami se počítá podíl aktivovaných neutrofilů (DAN,%) obsahujících granule diformazanu. Podle množství dipherformazanu uloženého v buňkách se jejich aktivita vyhodnocuje v libovolných jednotkách a vypočte se index aktivace neutrofilů (IAN, použité jednotky):
kde je HNeg. - počet buněk, které neobsahují diformazanové granule;
H1 - počet buněk, ve kterých je plocha diformazanových ložisek menší než 1/3 plochy jádra;
H2 - počet buněk, ve kterých se vklady diformazanu odebírají od 1/3 po celou velikost jádra;
H3 - počet buněk, ve kterých deformazanová ložiska zaujímají větší plochu jádra.
Odvození koeficientu mobilizace (KM) provedeného podle následujícího vzorce: