Biochemická diagnostika onemocnění jater. Stručná informace o struktuře jater.

Játra jsou nepárový orgán o hmotnosti 1300 - 1800 g. Více než 60% jaterních buněk jsou parenchymální buňky - hepatocyty, 25% jsou buňky retikulohistiocytického systému (CSG), endotheliální nebo Kupfferovy buňky, zbytek tvoří duktální, pojivová tkáň a další buňky.

Strukturní a funkční jednotka jater je jaterní acinus nebo jaterní loj, který je tvořen primárně z hepatocytů (obr. 1). Ve středu jaterní žíly je jaterní žíla, ze které vyzařují paprsky jater, sestávající hlavně z jedné řady hepatocytů. Jaterní žíla se nachází ve středu louly a na periferii je portální pole s větvemi jaterní tepny, portální žíly a nejmenší žlučové kapiláry. Mezi paprsky jsou rozšířené kapiláry - dutiny jater. Hepatocyty, které tvoří paprsky, se na jedné straně nazývají cévní pól, čelí sinusům, a invaginace membrány sousední strany, nazývané žlučový (biliární) pól, tvoří primární žlučové kapiláry (obr. 2). Charakteristickým znakem žlučových kanálků je jejich úplná izolace od krevních kapilár. Prostřednictvím membrány endocytosy cévní póly a exocytózy různých molekul, a žlučových cest - uvolňování látek z buňky. Portální žíla a jaterní tepna vstupují do jater a jaterní žíla a žlučovod vycházejí ven.

Acini je rozdělen do 3 funkčních zón: v 1 zóně jsou buňky sousedící s portálovým traktem, jsou lépe vybaveny kyslíkem a živinami. Buňky 3. zóny, umístěné kolem jaterní žíly, jsou méně zásobovány kyslíkem a substráty a jsou citlivější na ischemii. Jsou to buňky této zóny, které se podílejí na metabolismu léčiv a jsou cílem hepatotoxických léků.

Při provádění laboratorních studií pro správnou diagnózu je důležité znát distribuci enzymů uvnitř buňky. Dále jsou uvedeny údaje o enzymech, které se nejčastěji používají pro diagnostiku.

Cytoplazma obsahuje alaninaminotransferázu (ALT), součást aspartátaminotransferázy (AST), laktátdehydrogenázy (LDH), součást gamaglutamyltranspeptidázy (GGT) a dalších enzymů.

V mitochondriích (MX) většina AST (asi 70%), glutamát dehydrogenáza (GLDG), alkoholdehydrogenáza a mnoho dalších jsou koncentrovány.

Hrubý endoplazmatický retikulum obsahuje cholinesterázu (CE), atd.

V hladkém endoplazmatickém retikulu jsou glukóza-6-fosfatáza, UDP-glukuronyltransferáza, hem-obsahující membránově vázaný cytochrom P-450 a další.

Lysosomy obsahují kyselé hydrolázy (kyselá fosfatáza, ribonukleáza atd.), které jsou aktivovány snížením pH buňky.

Biliární póly obsahují enzymy závislé na membráně, jako je alkalická fosfatáza (alkalická fosfatáza), 5-nukleotidáza, část GGT, leucinaminopeptidáza (LAP).

Znalost architektury jater a distribuce enzymů v buňce objasňuje nerovnoměrné zvýšení aktivity enzymů v různých patologických procesech. S převažující lézí centrálních částí laloků (akutní alkoholická hepatitida, akutní žilní stáze atd.) Se zvyšuje aktivita mitochondriální glutamátdehydrogenázy - nedostatek kyslíku a poškození MX a porážka portálních drah (akutní virová hepatitida, chronická aktivní hepatitida - CAG) se zvyšuje aktivita cytoplazmatické transaminázy.

Biochemická diagnostika onemocnění

Kontaktní informace
Zboží a služby
Opravte

Klinická biochemie, spolu s patologickou a normální fyziologií, je jedním ze tří velryb základní lékařské vědy. Bez znalosti základů této disciplíny se lékař neliší od školáka, který má představu o nemocech pouze na základě symptomů a příznaků.

Mezitím klinické a biochemické ukazatele, které sledují změny v buňkách na úrovni molekul a chemických reakcí, umožňují spolehlivě určit příčiny patologických stavů těla jako celku. Záleží na úrovni školení klinika, jak kompetentně přistupuje k výběru nezbytných biochemických analýz pro komplexní vyšetření pacienta a bude také schopen vyhodnotit jejich diagnostické informace, hodnotu a spolehlivost.

V medicíně jsou široce využívány laboratorní biochemické studie pro:

- přesné stanovení diagnózy,

- detekce onemocnění v preklinickém stadiu,

- vyhodnotit účinnost předepsané léčby,

- sledování stavu pacienta

- predikce možných komplikací a výsledků onemocnění.

Doporučené biochemické testy

Byly vyvinuty standardizované výzkumné metody pro hlavní systémy těla, které musí být provedeny bez selhání s odpovídajícím komplexem symptomů:

Patologie kardiovaskulárního systému.

Angina pectoris (koagulogram, cholesterol s frakcemi, aminotransferázy, triglyceridy, lipoproteinové frakce, aterogenní index, laktát dehydrogenáza s isoenzymy, kreatin kináza s isoenzymy);

Hypertenze (cholesterol s frakcemi, cholinesteráza, močovina, kyselina močová, kreatinin, triglyceridy, aterogenní index, hladina elektrolytů K a Na);

Ateroskleróza (cholesterol s frakcemi, lipoproteinové frakce, triglyceridy, aterogenní index);

Infarkt myokardu (stresové proteiny, kreatinkináza s isoenzymy, aminotransferázy, močovina, cholinesteráza, koagulogram, kyselina močová, laktátdehydrogenáza s isoenzymy);

Hypotenze (17ОКС, obsah hydrokortizonu v moči).

Patologie systému pojivové tkáně.

Revmatismus (celkový protein s proteinovými frakcemi, glykoproteiny, testy sedimentů, stresové proteiny, hexózy glykoproteinů, fibrinogen, kyseliny sialové);

Revmatoidní artritida (protein běžný u proteinových frakcí, glykoproteinů, sialových kyselin);

Dna (celkový protein s proteinovými frakcemi, kreatinin, kyselina močová, stresové proteiny, glykoproteiny);

Sklerodermie (celkový protein s proteinovými frakcemi, fibrinogen, stresové proteiny, hydroxyprolin).

Patologie žlučového a gastrointestinálního systému.

Onemocnění žlučových cest (bilirubin s frakcemi, alkalická fosfatáza, Y-glutamyl transpeptidáza);

Atrofická gastritida (pepsinogen, gastrin);

Chronická pankreatitida (glukóza, glukózová tolerance, celkový protein s proteinovými frakcemi, amyláza s izoenzymy, lipáza v moči a v krvi);

Nekróza slinivky břišní (amyláza);

Dystrofické degenerativní změny v játrech, mastné formě (močovina, glutamátdehydrogenáza, alaninaminotransferáza, cholinesteráza, aspartátaminotransferáza);

Jaterní cirhóza (močovina, cholesterol, aspartátaminotransferáza, kreatinin, alaninaminotransferáza, proteinové frakce, β lipoproteiny, sedimentární vzorky);

Chronická hepatitida (stejný výzkum jako v cirhóze, plus laktátdehydrogenáza s isoenzymy, celkový protein, alkalická fosfatáza);

Hepatitida je akutní (stejný výzkum jako v chronické formě, s výjimkou alkalické fosfatázy a močoviny).

Patologie dýchacího ústrojí.

Absces plic, akutní bronchitida, bronchiální astma (celkový protein s frakcemi, stresový protein);

Bronchiektázy (stejné, plus fibrinogen);

Chronická pneumonie (celkový protein s frakcemi, stresový protein, laktát dehydrogenáza s isoenzymy);

Akutní pneumonie (stejně jako chronické, plus glykoproteiny, sedimentární vzorky, kyseliny sialové)

Tuberkulóza (celkový protein s frakcemi, stresový protein, kyseliny sialové, glykoprotein, vzorky sedimentů).

Patologie močového systému.

Selhání ledvin, akutní a chronické (celkový protein s frakcemi, kreatinin, protein moči, močovina, obsah elektrolytů Na, Cl, K, Ca);

Onemocnění ledvin (stejně jako v případě nedostatečnosti, plus kyseliny močové a elektrolytu P, s výjimkou Cl);

Nefrotický syndrom (stejný jako u nedostatečnosti, plus elektrolytový Mg s výjimkou Cl);

Amyloidóza ledvin (stejná jako u nedostatečnosti, plus elektrolytový Mg s výjimkou Cl a Y - glutamyl transpeptidázy);

Chronická pyelonefritida (běžný protein s frakcemi, stresové proteiny, alkalická fosfatáza, cholinesteráza, protein moči, Y-glutamyl transpeptidáza);

Glomerulonefritida (celkový protein s frakcemi, stresové proteiny, močovina, Y-glutamyltranspeptidáza, kreatinin, laktátdehydrogenáza s isoenzymy, cholinesteráza).

Patologie endokrinního systému.

Diabetes mellitus (glukóza v moči a v krvi, inzulín, aceton, cholesterol, beta-lipoproteiny, s pravděpodobností skryté formy - test citlivosti na glukózu);

Cukrovka bez cukru (glukóza, vazopresin, glukózový toleranční test);

Hypoparatyreóza (alkalická fosfatáza, obsah elektrolytů K a P v krvi a moči);

Hypotyreóza (tyroxin, trijodthyronin, triglyceridy, beta-lipoproteiny, cholesterol, močovina);

Hnisavá tyreoiditida (tyroxin, trijodthyronin, stresové proteiny, celkový protein s frakcemi);

Autoimunitní tyreoiditida (tyroxin, trijodthyronin, absorpce jódu131 štítnou žlázou, jód vázaný na proteiny);

Goiter je endemický (stejně jako u autoimunitní formy tyreoiditidy, plus cholesterolu a močoviny v moči);

Goiterova difuzní, toxická (tyroxin, trijodthyronin, TSH, jódový protein, glukóza, močovina, cholesterol).

Pokud to lékař považuje za nezbytné, jsou kromě hlavních doplňkových laboratorních testů jmenovány. (Podívejte se na léčbu)

Dekódování biochemické analýzy krve

Co ukazuje biochemické vyšetření krve?

Krev je jednou z biomateriálů těla. Je přítomen ve všech orgánech a tkáních. Jeho složení zahrnuje látky, které vznikají při práci všech orgánů. Krevní test pro biochemii určuje přítomnost a úroveň jeho složek.

Porovnáním údajů diagnostiky a normálních hodnot je možné určit funkční stav orgánů, určit povahu patologických stavů v nich. U některých onemocnění je biochemie krve jediným způsobem, jak objektivně potvrdit diagnózu.

Kromě hlavních (glukóza, hemoglobin, kreatinin, cholesterol a další), biochemická analýza také odhaluje specifické ukazatele (elektrolyty, sérum, revmatoidní faktor a další) nezbytné pro diagnostiku endokrinologických a genetických onemocnění. Metoda je také použitelná v pediatrii, sportovní medicíně k posouzení funkčního stavu těla dětí, sportovců.

Jaké jsou indikace biochemické analýzy krve?

Často je biochemie předepisována pacientům nebo ambulantním pacientům. K diagnostice nebo monitorování účinnosti léčby se provádí krevní test. Lékař individuálně stanoví seznam ukazatelů, jejichž úroveň musí být u pacienta stanovena. To může být jeden ukazatel (například glukóza u diabetes mellitus) nebo několik ukazatelů (například testy jaterních funkcí - celkový protein, bilirubin, protrombinový index, ALT, AST - u hepatitidy).

Indikace pro studii jsou choroby:

hepatobiliární systém;
ledviny;
endokrinní systém;
srdce;
pohybového aparátu;
oběhový systém;
gastrointestinálního traktu.

V kombinaci s metodami instrumentální diagnostiky pomáhá biochemie krve při správném stanovení diagnózy v patologii vnitřních orgánů.

Jak udělat krevní test pro biochemii?

Biochemická analýza zkoumá venózní krev. Vezměte biomateriál z periferních (ulnárních nebo radiálních) žil. S omezeným přístupem k předloktí (zlomeniny, popáleniny atd.) Se odebírá krev z jiné žíly (na rukou, nohou, nohou).

Před provedením analýzy by měl pacient připravit:

8 hodin před darováním krve nelze jíst, pít nápoje obsahující cukr;
po dobu 2 dnů se musíte zdržet konzumace alkoholu a tukových potravin;
v předvečer studie se vyhněte fyzickému a emocionálnímu stresu.

Analýza se provádí před medikací, před diagnostickými a terapeutickými postupy (rentgenové vyšetření, fyzioterapie atd.).

Místo vpichu kůže je ošetřeno antiseptickým - 96% ethanolem nebo roztokem peroxidu vodíku. Krev v objemu 5 až 10 ml se odebere do sterilní suché zkumavky, která se odešle do studie.

Normy biochemické analýzy krve (tabulka)

Norma u dospělých

U dětí do 14 let

Celkový bilirubin (tbil)

až 250 µmol / l (novorozenci)

Přímý bilirubin (idbil)

Alkalická fosfatáza (alp)

Lipoproteiny VP (hdl)

Až 6 g / l (během těhotenství)

Kyselina močová (kyselina močová)

C-reaktivní protein (crp)

Antistreptolysin O (také aslo)

Jak rozluštit biochemickou analýzu?

Rozluštění biochemické analýzy krve je srovnání výsledků získaných s normami ukazatelů. Formulář analýzy obsahuje úplný seznam látek určených biochemickou laboratoří a jejich referenční hodnoty. Někdy stačí stanovit konečnou diagnózu na základě odchylky od normy jednoho nebo několika parametrů. Ale častěji, abyste to potvrdili, potřebujete výsledky dalšího výzkumu. Dále bude uvažováno, což znamená odchylku od norem hlavních ukazatelů biochemie krve, pro které je typická.

Celkový protein

Celkový protein je soubor proteinů v krevní plazmě. Jeho hladina pomáhá identifikovat nemoci vnitřních orgánů a krve. Ukazatel roste v podmínkách:

dehydratace těla (zvracení, průjem, popáleniny atd.);
akutní a chronické infekce;
onkologických onemocnění.

Úroveň celkového proteinu klesá s:

nedostatek bílkovin při hladovění;
onemocnění jater;
akutní a chronické krvácení;
thyrotoxikóza.

Bilirubin

Bilirubin je žlučový pigment, který vzniká v důsledku destrukce červených krvinek. K metabolismu dochází v důsledku normální funkce jater. Jeho hladina se liší podle onemocnění jater, žlučových cest, anémie. Bilirubin je volná a vázaná frakce. Zvýšení prvního indikátoru nastane, když:

akutní virová, toxická, léková hepatitida;
bakteriální poškození jater (leptospiróza, brucelóza atd.);
jaterní tumory, primární biliární cirhóza;
hemolytickou anémii.

Zvýšený obsah vázaného bilirubinu je typický pro onemocnění, která narušují tok žluči:

žlučové kamenné onemocnění;
nádor pankreatu;
zánětlivá onemocnění žlučových cest atd.

Enzymy

Enzymová aktivita charakterizuje stav vnitřních orgánů. Zvýšený výkon s porážkou organických buněk. Zvýšení hladiny aminotransferázy ALAT, ALAT nastává, když:

akutní, chronická hepatitida;
nekróza jater;
infarkt myokardu;
poranění a onemocnění kosterních svalů;
cholestáza;
těžké hypoxie tkáně.

Zvýšené hladiny laktátdehydrogenázy (LDH) jsou typické pro:

infarkt myokardu, ledviny;
myokarditida;
rozsáhlá hemolýza;
plicní embolie;
akutní hepatitida.

Vysoké hladiny kreatin fosfokinázy (CPK) se mohou objevit, když:

infarkt myokardu;
nekróza kosterních svalů;
epilepsie;
myositida a svalová dystrofie.

Močovina patří do skupiny substrátů - sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností, která je syntetizována v játrech. Hladina látky v krvi závisí na filtrační schopnosti ledvin a syntetické funkci jater. Důvody zvýšení:

onemocnění ledvin (glomerulonefritida, amyloidóza, pyelonefritida, léčba nefrotoxickými léky);
kardiovaskulární selhání;
masivní ztráta krve;
popáleniny;
porušení odtoku moči;
jíst přebytek bílkovin.

Důvody pro snížení hladiny močoviny:

půst a přísná vegetariánství;
otrava jedy;
těhotenství;
porušení syntetické funkce jater.

Kyselina močová

Kyselina močová je konečný produkt metabolismu určitých proteinů. Jeho hlavní část je vylučována ledvinami, zbytek - výkaly. Zvýšení hladiny kyseliny močové v krvi ukazuje následující stavy:

selhání ledvin;
leukémie;
lymfom;
prodloužené půst;
zneužívání alkoholu;
předávkování salicyláty a diuretiky.

Kolik je biochemický krevní test?

Cena biochemických krevních testů závisí na počtu určených parametrů. Cena každého z nich se pohybuje od 130 do 300 rublů. Nejdražší metodou biochemických krevních testů je imunoelektroforéza, jejíž náklady na některých klinikách dosahují 1000 rublů.

Biochemie a patobiochemie jater. Biochemická diagnostika onemocnění jater

Biochemická diagnostika onemocnění jater.

BIOCHEMICKÁ DIAGNOSTIKA ŽIVÝCH CHOROB.

Stručná informace o struktuře jater.

Cytoplazma obsahuje alaninaminotransferázu (ALT), součást aspartátaminotransferázy (AST), laktátdehydrogenázy (LDH), součást gamaglutamyltranspeptidázy (GGT) a dalších enzymů.

V mitochondriích (MX) většina AST (asi 70%), glutamát dehydrogenáza (GLDG), alkoholdehydrogenáza a mnoho dalších jsou koncentrovány.

Hrubý endoplazmatický retikulum obsahuje cholinesterázu (CE), atd.

V hladkém endoplazmatickém retikulu jsou glukóza-6-fosfatáza, UDP-glukuronyltransferáza, hem-obsahující membránově vázaný cytochrom P-450 a další.

Lysosomy obsahují kyselé hydrolázy (kyselá fosfatáza, ribonukleáza atd.), které jsou aktivovány snížením pH buňky.

Biliární póly obsahují enzymy závislé na membráně, jako je alkalická fosfatáza (alkalická fosfatáza), 5-nukleotidáza, část GGT, leucinaminopeptidáza (LAP).

Játra se nazývají centrální metabolická laboratoř, protože stejně účinně přeměňují látky ze střev a metabolických produktů vzniklých v různých orgánech a tkáních v důsledku jejich vitální aktivity. V současné době je známo více než 500 metabolických funkcí. Stručně zvažte hlavní.

1. Syntetika. Játra syntetizují proteiny, enzymy, koagulační faktory, cholesterol, fosfolipidy atd. Hlavní tvorba ketonových těl se vyskytuje v játrech.

2. Detoxikace pro endogenní (amoniak, bilirubin, atd.). a exogenní látky). Detoxikace léčiv zahrnuje 2 fáze: 1 - modifikace léčiv v redox reakcích za použití cytochromu P 450 a konjugace léčiv s látkami rozpustnými ve vodě přidáním glukuronové kyseliny, kyseliny sírové, glutathionu atd. V případě onemocnění jater jsou reakce první fáze sníženy nebo chybí.

3. Sekrece - vylučování žluči. Zařízení pro sekreci žluče zahrnuje žlučové kanálky, mikrovily, lysozomy sousedící s nimi a Golgiho komplex. Mechanismus vylučování žluči zahrnuje uvolňování cholesterolu, žlučových kyselin, pigmentů, fosfolipidů ve formě specifického makromolekulárního komplexu - žlučové micely. Primární žlučové kyseliny vytvořené v játrech vstupují do střeva, kde jsou působením střevní flóry přeměněny na sekundární žlučové kyseliny. Ty se absorbují ve střevě a znovu vstupují do jater (enterohepatická cirkulace). Játra je konjugují s glycinem a taurinem a mění je na amfifilní sloučeniny s vysokou schopností emulgovat hydrofobní sloučeniny. látek. Všechny procesy, které způsobují porušení poměru složek v žluči (hormonální, zánětlivé, atd.), Vedou k narušení sekrece žluči - cholestázy.

4. Exkrece - vylučování žlučem různých látek, včetně pevných látek.

Játra se účastní všech typů metabolismu.

1. Výměna proteinů. Játra syntetizují následující proteiny:

albumin 100%, fibrinogen

₁-globuliny 90%, faktory srážení krve

₂-globuliny 75% (včetně vitaminu K)

-globuliny 50%, pseudocholinesteráza (CE)

Albumin patří k nejlehčím krevním proteinům, OMM 65-70 kD a je syntetizován výhradně v játrech. Albuminy udržují onkotický tlak, pokles jejich obsahu vede k otoku. Pokud snížení koncentrace albuminu není spojeno s podvýživou, porušením intestinální absorpce nebo velkou ztrátou proteinu, je to způsobeno výrazným snížením funkce jater. Albuminy hrají důležitou roli v transportu látek, které jsou špatně rozpustné ve vodě (hydrofobní). Tyto látky zahrnují bilirubin, cholesterol, mastné kyseliny, řadu hormonů a léků. Porušení transportní funkce albuminu vede k mnoha patologickým změnám.

Játra udržují hladinu aminokyselin, vč. cyklický (tyrosin, tryptofan, fenylalanin), neutralizuje amoniak a mění ho na močovinu. Syntéza močoviny je jednou z nejstabilnějších funkcí jater.

2. Výměna lipidů. Syntéza cholesterolu je 90% prováděna játry a střevy. Významná část cholesterolu v játrech je přeměněna na žlučové kyseliny, steroidní hormony, vitamin D₂. Játra přeměňují mastné kyseliny s krátkým řetězcem, které jsou toxické pro mozek (4-8 atomů uhlíku - kyselina kaprová, kyselina isovalerová atd.), Do mastných kyselin s dlouhým řetězcem (16-18 atomů uhlíku).

3. Výměna sacharidů. Játra udržují stabilní úroveň glykémie glykogenezí, glykogenolýzou, glukoneogenezí. Játra produkují inzulinázy - enzymy, které štěpí inzulin, podporují hladinu kyseliny mléčné a pyrohroznové.

4. Pigmentový metabolismus zahrnuje přeměnu toxického, v tuku rozpustného nepřímého bilirubinu na netoxickou, ve vodě rozpustnou přímou příměs. K uvolnění bilirubujícího glukuronidu může dojít buď přímou sekrecí do žlučové kapiláry, nebo inkorporací do žlučové micely.

5. Porfyrinový metabolismus zahrnuje syntézu hem sestávajícího z komplexu protoporfyrinu se železem. Heme je nezbytný pro syntézu jaterních enzymů obsahujících hem (cytochromy atd.). Vrozená abnormalita syntézy hemu v játrech vede k onemocněním - jaterní porfyrii.

6. Výměna hormonů. U onemocnění jater je pozorováno zvýšení hladin hormonů, které je spojeno s porušením jejich sekrece žlučem nebo narušením normálního metabolismu hormonů (nedostatečná destrukce). Zvyšuje se hladina adrenalinu a noradrenalinu (mediátory sympatického nervového systému), mineralokortikoidní aldosteron, pohlavní hormony, zejména estrogeny, tkáňové hormony serotonin a histamin.

7. Výměna stopových prvků. Játra syntetizují proteiny pro transport (transferin) a depozici (feritin) železa, je také hlavním depotem železa. Játra hrají důležitou roli v metabolismu mědi: syntetizuje ceruloplasmin, glykoprotein, který váže až 90% krevní mědi, a také absorbuje měď, která je volně vázána na albumin z krevní plazmy a vylučuje přebytečnou měď přes lysosomy se žlučem do střeva. Játra se podílejí na výměně dalších stopových prvků a elektrolytů.

Hlavní syndromy u onemocnění jater.
Při různých onemocněních jater jsou narušeny určité typy metabolismu nebo určité funkce orgánu. Některé nemoci jsou doprovázeny převážným poškozením jaterních buněk. jiní - primární porušení odlivu žluči, atd., takže diagnóza onemocnění jater je často prováděna syndromem. V následujícím textu jsou popsány hlavní syndromy (Tabulka 7).

1. Cytolytický syndrom (cytolýza) vzniká v důsledku narušení struktury jaterních buněk, zvýšení permeability membrány, zpravidla v důsledku zvýšených procesů peroxidace lipidů (LPO) a uvolňování enzymů do krve. V cytolytickém syndromu vstupují obě cytoplazmatické i mitochondriální složky enzymů do krevního oběhu, ale hlavní úroveň aktivity určují cytoplazmatické izoenzymy. Cytolýza doprovází zejména akutní jaterní onemocnění a zvyšuje se exacerbací chronických. Rozlišují se tyto hlavní mechanismy cytolýzy:

1) toxická cytolýza (virová, alkoholická, léčivá);

2) imunitní cytolýza, vč. autoimunní;

4) hypoxický („šoková játra“ atd.);

5) cytolýzu nádoru;

6) cytolýza spojená s nutričními nedostatky a nedostatečností potravin.

Cytolýza není identická s nekrózou buněk: během cytolýzy zůstává buňka naživu a schopna různých typů metabolismu, včetně syntézy enzymů, proto se během cytolýzy enzymová aktivita může zvyšovat desítky nebo stovkykrát a zůstává dlouhá. Nekróza znamená smrt buněk, takže vzestup aktivity enzymu může být významný, ale krátkodobý.

Hlavními dostupnými markery cytolýzy při akutní hepatitidě jsou alanin (ALT) a aspartátové (AST) transaminázy, gama-glutamyl transpeptidáza (GGT), laktátdehydrogenáza (LDH).

Zvýšené hodnoty ALT a AST pozorováno u 88-97% pacientů v závislosti na typu hepatitidy, více než polovina z nich je signifikantní (10-100 krát). Maximální aktivita je charakteristická pro 2-3 týden týdne a návrat do normálu je 5-6 týdnů. Překročení normalizace aktivity je nepříznivým faktorem. ALT aktivita> AST, která je spojena s distribucí AST mezi cytoplazmou a mitochondriemi. Převažující zvýšení AST je spojeno s mitochondriálním poškozením a je pozorováno při závažnějším poškození jater, zejména alkoholu. Aktivita transaminázy se mírně zvyšuje (2-5 krát) při chronických onemocněních jater, obvykle v akutní fázi a nádorech jater. Pro cirhózu jater není zvýšení aktivity tranamináz, zpravidla charakteristické.

Gama-glutamyl-transpeptidáza (GGT, GGTP, -GT) je obsažena v cytoplazmě (izoforma s nízkou molekulovou hmotností) a je spojena s membránami žlučového pólu (izoforma s vysokou molekulovou hmotností). Zvýšení jeho aktivity může být spojeno s cytolýzou, cholestázou, intoxikací alkoholem nebo léky, růstem nádoru, a proto zvýšení aktivity GGT není specifické pro konkrétní onemocnění, ale do určité míry univerzální nebo pro screening onemocnění jater, i když zahrnuje další vyhledávání příčiny onemocnění.

Laktát dehydrogenáza (LDH) se zvyšuje s mnoha chorobami. Diagnostická hodnota celkové aktivity je malá a je omezena na definici vylučující nádorové a hemolytické procesy, jakož i diferenciální diagnostiku Gilbertova syndromu (normální) a chronické hemolýzy (zvýšené). Pro diagnózu onemocnění jater významnější hodnocení jaterního isoenzymu LDH - LDH₅.

Zvýšení aktivity jednoho nebo všech enzymů indikuje akutní onemocnění jater, exacerbaci chronického onemocnění nebo nádorového procesu, ale neindikuje povahu onemocnění a neumožňuje diagnózu.
2. Cholestatický syndrom (cholestáza) je charakterizován porušením sekrece žluči. Někteří autoři identifikují vzácnou anekerickou formu cholestázy spojenou se změnami v normálních poměrech složek žluči (hormonální změny, poruchy enterohepatické cirkulace cholesterolu). Intrahepatická cholestáza spojená se sníženou sekrecí žluči hepatocyty nebo tvorbou žlučových cest ve žlučovodech a extrahepatickou cholestázou v důsledku obstrukce žlučových cest kamenem, nádorem nebo podáváním léků způsobujících cholestázu. S cholestázou se látky, které se vylučují ve žluči u zdravých lidí, vstřebávají a hromadí v krevní plazmě a zvyšuje se aktivita tzv. Indikátorů cholestázy. Typická ikterická forma cholestázy je charakterizována svěděním a žloutenkou.

Cholestasis zvyšuje obsah žlučových kyselin; bilirubin s převažujícím nárůstem v konjugované části žluči (cholebilirubin); cholesterol a -lipoproteiny; enzymová aktivita alkalická fosfatáza, GGT, 5-nukleotidáza.

Alkalická fosfatáza (alkalická fosfatáza) vykazuje svou aktivitu při pH 9-10, je obsažen v játrech, střevech, kostní tkáni, ale hlavním vylučovacím orgánem jsou játra. V hepatocytech je alkalická fosfatáza asociována s membránami žlučového pólu a epiteliálních mikrovilů žlučových cest. Příčiny hyperfermentemie jsou zpožděná eliminace enzymu v žluči a indukce enzymové syntézy v závislosti na bloku enterohepatické cirkulace. Zvýšená aktivita u onemocnění jater nejčastěji indikuje cholestázu, při které se aktivita enzymů zvyšuje o 4 až 10 dní až 3krát nebo vícekrát, stejně jako tumory jater. Se zvyšující se aktivitou alkalické fosfatázy by měla být diferenciální diagnóza onemocnění kostí.

5-nukleotidáza patří do skupiny alkalických fosfatáz, liší se paralelně s nimi, ale zvýšení jeho aktivity je spojeno výhradně s cholestázou. Nedostatek dostupných komerčních sad však neumožňuje tento indikátor plně využít.

GGT Je také enzymem navázaným na membránu as cholestázou vzniká díky aktivaci syntézy. Studie GGT s cholestázou je považována za povinnou.

Narušení vylučování žlučí vede ke zhoršení emulgace tuků a snížení absorpce látek rozpustných v tucích ve střevě, včetně vitaminu K. Snížení množství vitamínu K v těle vede ke snížení syntézy koagulačních faktorů závislých na vitaminu K a snížení protrombinového indexu (PTI). Při intramuskulárním podání vitaminu K s cholestázou se PI za den zvyšuje o 30%.

3. Hepatodepresivní syndrom zahrnuje jakoukoliv dysfunkci jater, která není doprovázena encefalopatií. Syndrom se vyskytuje v mnoha onemocněních jater, ale je nejvýraznější při chronických procesech. Pro označení syndromu se používají zátěžové testy a stanovení koncentrace nebo aktivity různých složek séra nebo plazmy.

Zátěžové testy jsou citlivé, ale zřídka používané. Patří mezi ně:

a) testy vylučovací funkce jater - bromsulfaleinu, indocyanova atd.;

b) testy na detoxikační funkci jater - antipyrin, kofein, rychlý vzorek.

Studie ukázaly, že syntetická funkce je nejméně stabilní pro onemocnění jater a syntéza těchto látek, které vznikají hlavně v játrech, se snižuje především. Dostupné a informativní ukazatele hepatodecrece jsou následující:

1. Albumin téměř kompletně syntetizován játry. Snížení jeho koncentrace je pozorováno u poloviny pacientů s akutní a 80-90% pacientů s CAH a cirhózou jater. Hypoalbuminemie se vyvíjí postupně, výsledkem může být snížení onkotického krevního tlaku a edému, jakož i snížení vazby hydrofobních a amfifilních sloučenin endogenní a exogenní povahy (bilirubin, volné mastné kyseliny, léky atd.), Které mohou způsobit jevy intoxikace. Informativní paralelní stanovení albuminu a celkového proteinu. Celkový obsah proteinu zpravidla zůstává normální nebo se zvyšuje v důsledku imunoglobulinů (Ig) na pozadí poklesu koncentrace albuminu. Redukce albuminu na 30 g / l nebo méně naznačuje chronický proces.

2 -1-antitrypsin - glykoprotein tvořící 80-90% frakce ₁-globulin, protein akutní fáze, syntetizovaný v játrech, je citlivým indikátorem zánětu parenchymálních buněk. Výjimečný diagnostický význam spojený s vrozeným nedostatkem bílkovin, vedoucí k těžkým formám poškození jater a dalších orgánů u dětí.

3. Cholinesteráza (pseudo-cholinesteráza, butyrylcholinesteráza - HE, BChE), syntetizované játry, označuje₂-globuliny. Jednou z jejich funkcí je štěpení svalových relaxancií odvozených od sukcinyl dicholinu (listenon, ditilin). Nedostatek enzymu nebo výskyt atypických forem komplikuje rozpad léků, což komplikuje proces zotavení z anestézie. Aby se zabránilo pooperačním komplikacím, doporučuje se stanovit aktivitu enzymu a číslo dibukinu, tj. stupeň inhibice enzymu dibucainu. Při chronických procesech, zejména cirhóze jater, se aktivita enzymů snižuje a stupeň redukce má prognostickou hodnotu. Dalším důvodem snížení aktivity je otrava organofosfátem.

4. Fibrinogen, I koagulační faktor, protein akutní fáze, označuje ₂-globuliny. Hladina fibrinogenu se přirozeně snižuje při závažných chronických a akutních onemocněních jater.

5. PTI snižuje v důsledku zhoršené syntézy koagulačních faktorů závislých na vitaminu K (II, VII, IX, X). Na rozdíl od cholestázy není hladina IPT normalizována intramuskulárním podáním vitaminu K. IPT je ukazatelem závažnosti akutní dysfunkce jater.

6. Cholesterol snížení krevního tlaku u pacientů s chronickou hepatitidou a cirhózou jater, častěji s subakutní variantou kurzu. V mastných játrech se může zvýšit hladina cholesterolu.

U chronických onemocnění jater ve stadiu kompenzace je zvýšení aktivity enzymů netypicky. Mírné zvýšení (faktorem 1,5–3) aktivity transamináz s vyšší hladinou AST však naznačuje poškození subcelulárních struktur, zejména MX.

4. Mezenchymální zánětlivý syndrom je způsoben poškozením mesenchymu a stromatu jater, je to v podstatě imunitní reakce na antigenní stimulaci střevního původu. Tento syndrom doprovází akutní i chronická onemocnění jater. Syndromové markery jsou glob-globuliny, imunoglobuliny, thymolový test, protilátky proti buněčným prvkům atd.

Definice -globuliny odkazuje na povinné testy na játra. Vzestup -globulinů, které jsou v podstatě imunoglobuliny, je charakteristický pro většinu onemocnění jater, ale je nejvýraznější u CAG a jaterní cirhózy. Nedávno bylo prokázáno, že p-globuliny mohou být produkovány Kupfferovými buňkami a plazmatickými buňkami zánětlivých infiltrátů jater. S cirhózou jater na pozadí nízké koncentrace albuminu, v důsledku porušení syntetické funkce jater, je pozorován významný nárůst α-globulinů, zatímco koncentrace celkového proteinu může zůstat normální nebo zvýšená.

Imunoglobuliny (Ig) jsou proteiny zahrnuté ve frakci -globulinu a mají vlastnosti protilátek. Existuje 5 hlavních tříd Ig: IgA, IgM, IgG, IgD, IgE, ale první tři se používají pro diagnostiku. U chronických onemocnění jater se zvyšuje obsah všech tříd Ig, ale růst IgM je nejvýraznější. Při alkoholickém poškození jater je pozorováno zvýšení IgA.

Thymolový test - nespecifická, ale cenově dostupná výzkumná metoda, jejíž výsledek závisí na obsahu IgM, IgG a lipoproteinů v séru. Test je pozitivní u 70-80% pacientů s akutní virovou hepatitidou v prvních 5 dnech ikterického období, u 70-80% pacientů s CAH au 60% s jaterní cirhózou. Vzorek je normální u obstrukční žloutenky u 95% pacientů.

Protilátky proti tkáňovým a buněčným antigenům (nukleární, hladký sval, mitochondriální) umožňují identifikovat autoimunitní složky při onemocněních jater.

Další výzkumné metody zahrnují definici haptoglobin, orozomukoida, ₂-makroglobulin, ₂-mikroglobulin, hydroxyprolin, uronové kyseliny.
Tabulka 1.

Biochemická diagnostika onemocnění

Biochemická diagnostika Biochemická diagnostika (klinická chemie (biochemie), patchemie) - směr klinické laboratorní diagnostiky, jejímž cílem je sledovat stav pacienta a diagnostikovat nemoci identifikací chemických složek v biomateriálu (krev, moč, v některých případech výkaly, pleurální nebo mozkomíšní tekutiny).

Krevní plazma je tekutina organismu, která má komplexní chemické složení, včetně velkého množství anorganických iontů, enzymů, hormonů, proteinů, lipidů a sacharidů, jakož i rozpuštěných plynů - oxidu uhličitého a kyslíku. Koncentrace všech složek krve u zdravého člověka je v určitých mezích, což odráží normální funkční stav organismu jako celku i každé jeho buňky odděleně. V případě různých onemocnění dochází k porušení funkcí orgánů a systémů, což vede k nerovnováze a koncentraci jedné nebo více krevních složek. Chemická analýza krve v procesu diagnózy je založena na tomto principu. Seznam patologických stavů, ve kterých je nezbytná biochemická analýza krve a moči, je poměrně široký a zahrnuje onemocnění kardiovaskulárního, endokrinního, respiračního, vylučovacího a dalších systémů. Nemoci vyplývající z podvýživy jsou také diagnostikovány pomocí biochemických krevních testů. Nedostatek potravin lze zjistit pomocí laboratorních diagnostických metod.

Některé typy nádorových buněk mohou také uvolňovat specifické látky do krevního oběhu. Úloha biochemických laboratoří při monitorování a diagnostice rakoviny je omezena na měření krevních hladin těchto „nádorových markerů“.

Bezpečnost a účinnost lékové terapie závisí na měření koncentrace léčivých látek v krvi. A to je jen jeden aspekt enormní role biochemické diagnostiky při monitorování terapie pacientů.

Většina krevních a močových testů se dnes provádí pomocí moderních high-tech automatizovaných diagnostických systémů, jejichž biochemické analyzátory umožňují provádět až 1000 testů za 1 hodinu, až 20 nebo více na každém vzorku. Výsledek diagnózy většiny testů se dostane do 12-24 hodin. Většina laboratoří provádí nepřetržitý specifický seznam testů, protože s urgentní diagnostikou musí být výsledky testu připraveny do 1 hodiny.

TAT (nebo rychlost laboratorní diagnostiky) je čas od okamžiku, kdy je test přiřazen času, kdy je výsledek testu přijat, nebo od doby, kdy je materiál odebrán do doby, kdy je výsledek testu přijat. TAT by měl odpovídat rychlosti vývoje patologického procesu, jakož i možnostem farmakologické nebo jiné korekce.

Někteří pacienti oddělení, jednotky intenzivní péče a jednotky intenzivní péče často vyžadují neustálé sledování některých krevních parametrů. Za těchto podmínek může sestra tohoto oddělení provést určitý omezený seznam testů za použití potřebného vybavení umístěného v oddělení.

KAPITOLA 4 BIOCHEMICKÁ DIAGNOSTIKA PATOLOGICKÝCH PROCESŮ A HEREDITÁRNÍCH CHOROB t

4.1. KARDIOVASKULÁRNA PATOLOGIE

V oblasti kardiovaskulární patologie dosáhla klinická biochemie největšího úspěchu v diagnostice infarktu myokardu. Metody klinické enzymologie a imunochemie umožňují diagnostikovat infarkt myokardu v prvních hodinách jeho výskytu, identifikovat klinický stav nestabilní anginy pectoris, provést diferenciální diagnózu těžké anginy pectoris (ischemie) a smrti myocytů (anoxie), vyhodnotit účinnost trombolytické terapie a fenoménu reperfúze.

V souladu s doporučeními WHO je diagnóza infarktu myokardu založena na typickém klinickém obrazu záchvatu bolesti na hrudi; Změny EKG; zvýšení krevní aktivity kardiospecifických enzymů (markerů).

Současně s opakovaným infarktem myokardu, kardiosklerózou a fibrilací síní, stejně jako v přítomnosti kardiostimulátoru u pacienta, je mnohem obtížnější diagnostikovat infarkt myokardu podle údajů EKG. Kromě toho více než 25% pacientů, u nichž byl při pitvě potvrzen infarkt myokardu, nemělo změny EKG. Podle prospektivní studie provedené ve Spojených státech lze diagnózu infarktu myokardu bez studie kardiospecifických markerů smrti myocytů provést pouze ve 25% případů.

U pacientů dodaných na jednotku intenzivní péče se srdeční bolestí má infarkt myokardu pouze 10-15%. Potřeba diagnostikovat infarkt myokardu v raných stadiích je dána skutečností, že trombolytická léčba v prvních 2-6 hodinách snižuje časnou mortalitu v průměru o 30% a léčba začala v 7-12 hodinách - pouze o 13%. Trombolytická léčba po 13-24 hodinách nesnižuje mortalitu.

Včasná diagnóza infarktu myokardu vám umožňuje aplikovat a transluminální angioplastiku a účinnost konzervativní léčby je vyšší, pokud je zahájena co nejdříve.

Je také nutné provést diferenciální diagnózu infarktu myokardu s nestabilní anginou pectoris, kdy časná léčba může zabránit infarktu myokardu.

V posledních letech byl arzenál biochemických markerů smrti myocytů doplněn o nové vysoce specifické testy, které vám umožní diagnostikovat infarkt myokardu v prvních hodinách jeho výskytu. Jedná se o testy, které lze aplikovat v první fázi lékařské péče, stejně jako stanovení kardiospecifických izoenzymů a proteinových markerů pro smrt myocytů používaných na jednotce intenzivní péče zdravotnických zařízení. Zároveň úspěch průmyslové technologie a uvolňování diagnostických systémů založených na principu "suché chemie" umožňuje stanovit specifické markery smrti myocytů v první fázi lékařské péče. Nicméně i za těchto podmínek jsou možné diagnostické chyby, pokud patofyziologie infarktu myokardu a mechanismy příjmu orgánově specifických a nespecifických proteinových markerů smrti myocytů do krve nejsou jasně pochopeny.

Lokalizace v buňce má významný vliv na rychlost uvolňování markeru z poškozeného myocytu. Enzymy cytosolu se uvolňují rychleji než ty, které jsou strukturovány na intracelulárních membránách. Na rozdíl od cytosolických markerů je nutné uvolnění intracelulárního kontraktilního aparátu k dosažení intersticiálního prostoru proteinů souvisejících se strukturou, což zpomaluje proces vzniku markerů v krvi; ty jsou uvolňovány mitochondriálními enzymy.

Při studiu srdečních markerů infarktu myokardu je třeba vzít v úvahu řadu ustanovení, označovaných jako principy diagnózy infarktu myokardu. Mezi ně patří: 1) časové intervaly; 2) studium markerů poškození myokardu v dynamice; 3) orgánově specifická laboratorní diagnostika infarktu myokardu; 4) komplexní charakter diagnózy; 5) koncept „šedé zóny“.

Prakticky významnými markery úmrtí myocytů jsou katalytická koncentrace KK, LDH, AST, glykogen fosforylázy (GF) v krvi, zvýšení krevního obsahu myoglobinu, myosinových řetězců, trooninů T. I. koncentrace izoenzymů KK-MB a LDH v krvi₁, imunochemické stanovení CK-MB a GF-BB, jakož i poměr izoforem isoenzymu CK-MB a troponinů.

V diagnostice infarktu myokardu je důležité zvážit dobu, která uplynula od nástupu anginy pectoris. Je to dáno tím, že od okamžiku smrti myocytů do vzniku markerů v krvi přechází poměrně dlouhá doba. Odtok velkých molekul proteinů (CC a LDH) z buněk může nastat pouze v případě, že je narušena integrita plazmatické membrány myocytů v důsledku jejich smrti během anoxie. Menší molekuly proteinových markerů (myoglobin, troponin) mohou v malém množství vypršet v buňkách a za podmínek prodloužené hypoxie s výraznými změnami v membráně myocytů, před destrukcí buněk. V prvních 4 hodinách po okluzi koronární tepny v zóně maximální ischemie nekrotizovalo asi 60% myocytů; nekróza zbývajících 40% nastane během následujících 20 hodin.

Molekuly proteinů vstupují za membránu myocytů a vstupují do extracelulární tekutiny a proudí ze srdce pouze lymfatickými kanály. To určuje poměrně dlouhou dobu (3-6 hodin) od doby smrti myocytů do vzniku kardiospecifických markerů v krvi. Především se zvyšuje obsah myoglobinu, GF-BB a troponinu v krvi, poté - KK a kardiospecifický izoenzym KK-MB, AST; významně později zvyšuje aktivitu LDH a srdečně specifického isoenzymu LDH₁ (Obr. 4.1). Klinická senzitivita kardiospecifických markerů do značné míry závisí na čase, který uplynul od smrti myocytů. Pro KK-MB, při detekci krve v prvních 3-4 hodinách po záchvatu anginy pectoris, je klinická senzitivita (diagnostická přesnost) pouze 25-45% a zvyšuje se na 98% v rozmezí 8-32 hodin.

Obr. 4.1. Dynamika aktivity enzymu v infarktu myokardu. 1 - MW-2 / MW-1; 2 - MM-3 / MM-1; 3 - KK-MB; 4 - celkem KK; 5 - LDH₁/ LDG₂

CK dává falešně negativní výsledky v 32% případů, AST - v 49%, myoglobin - v 15%. Aktivita LDH je spolehlivým markerem smrti myocytů po 12 hodinách od nástupu anginy, ale zůstává 10 až 12 dnů. Data o aktivitě kardiospecifických markerů v termínech kratších než 4-6 hodin po ataku anginy pectoris mohou vést k diagnostickým chybám, když ani při rozsáhlém infarktu myokardu nejsou markery smrti myocytů tak informativní. Kromě toho rychlost zvýšení obsahu srdečních markerů v krvi do značné míry závisí na délce ischemie a době recanalizace trombozonové koronární arterie a reperfúze myokardu po infarktu myokardu.

Druhým znakem uvolňování markerů smrti kardiomyocytů do krve je charakteristická dynamika růstu a snížení jejich koncentrace (katalytická koncentrace). To je určeno konstantní kontrakcí myokardu, která vede nejprve k rychlé eliminaci proteinů z nekrotizované oblasti myokardu a pak k úplnému vyluhování markerových proteinů do krevního oběhu. Pouze u infarktu myokardu se obsah markerů úmrtnosti kardiomyocytů v krvi zvyšuje v rozmezí 8-24 hodin, v případě nekomplikovaného infarktu myokardu dochází k podobně výrazné eliminaci markerových proteinů z cévního lůžka. Současně obsah každého ze značek „zapisuje“ obloukovou dynamickou křivku s různými časovými parametry. U většiny markerů dává plocha křivky představu o velikosti infarktu myokardu, což odráží množství nekrotické tkáně myokardu. Aktivita CC a CC-MB v krvi je zvýšena již se smrtí 1 g tkáně myokardu.

Jediná studie AST, KK nebo LDH má relativně nízkou klinickou specificitu - 66%, zvýšení aktivity enzymů nebo obsah proteinových markerů za 3-4 hodiny zvyšuje orgánovou specifičnost diagnózy až na 86%, třetí měření umožňuje diagnostikovat infarkt myokardu i při tak malém specifickém testu definice AST. Dynamická studie markerů smrti myocytů umožňuje diferenciální diagnózu mezi infarktem myokardu a hyperfermentemií s masivní lézí pruhovaných svalů. V období 8 až 24 hodin po ataku stenokardie je aktivita enzymů tak indikativní, že pokud nedochází k dynamickému zvýšení jejich aktivity v krvi, pak nedochází k infarktu myokardu.

Absolutně specifické markery poškození kardiomyocytů nebyly nalezeny. Specifičnost organismu v diagnóze pomocí izoenzymů QA je založena pouze na rozdílu v procentuálním poměru izoenzymů v jednotlivých orgánech a tkáních a následně v krevním séru, když jsou poškozeny.

Hodnota QC-MB. Izoenzym KK-MB je specifický pro myokard ne proto, že takový isoenzym není v jiných tkáních, ale proto, že jeho aktivita v kardiomyocytech je 15-42% celkové QC aktivity, zatímco jeho obsah v kosterní svalové tkáni nepřesahuje 4%, a pouze v červených, pomalu stahujících svalových vláknech. Za těchto podmínek, s porážkou myokardu a kosterních svalů, může být aktivita CC zvýšena ve stejném rozsahu, ale v procentech se aktivita CC-MB významně liší. Při infarktu myokardu obsah CK-MB přesahuje 6% celkové aktivity CK nebo 12 IU / l při teplotě 30 ° C.

Jak v patologii kosterních svalů, tak i při úmrtí kardiomyocytů v krvi se aktivita KK-MB zvyšuje, ale v prvním případě jeho aktivita nepřekročí 6% aktivity KK a ve druhém případě se zvýší na 12-20%. Doporučuje se současně vyjádřit aktivitu QC-MB v jednotkách 1 litr (IU / l) a jako procento aktivity QC. Stanovení aktivity KK-MB zůstává nejoblíbenějším testem v diagnostice infarktu myokardu. U infarktu myokardu u starších pacientů může být aktivita QC zvýšena pouze v malém rozsahu, ale s významným zvýšením aktivity QC-MB. U těchto pacientů je diagnosticky důležité zkoumat aktivitu CK-MB, a to i při ne tak výrazném zvýšení aktivity CK.

Při operacích na srdci (srdeční vady, koronární bypass), se QC-MB aktivita používá k diagnostice pooperačního infarktu myokardu. Ihned po operaci, v důsledku hypoxie a poškození myokardu, se aktivita KK-MB v krvi zvyšuje a vrátí se do normálu během 10-12 hodin, s rozvojem infarktu myokardu se aktivita KK-MB významně zvyšuje a má dynamiku charakteristickou pro infarkt myokardu.

Hodnota LDH. Aktivita LDH₁ charakteristika myokardu jako tkáně s anaerobním typem výměny. Za podmínek hypertrofie myokardu a chronické hypoxie, syntéza LDH₁ v kardiomyocytech se začíná zvyšovat. Při infarktu myokardu dochází k nárůstu katalytické koncentrace LDH v krvi v důsledku nárůstu

obsah izoenzymů LDH₁ a LDH₂ v poměru LDH₁/ LDG₂ více než 1. LDH - cytosolický enzym; Významné zvýšení aktivity LDH v krvi během infarktu myokardu nastane později než QC a AST, během jednoho dne pole atakování anginy pectoris; vysoká aktivita LDH₁ přetrvává 12-14 dní. Snížení aktivity LDH v krvi na normální se používá jako test, který indikuje dokončení periody resorpce nekrotizované tkáně myokardu. Pokud je aktivita LDH₁, Stanovené přímou metodou, s inhibicí podjednotky protilátkami M přesahuje 100 IU / l, je to spolehlivý signál infarktu myokardu.

Na rozdíl od izoenzymů M podjednotky a LDH₃ (MMNN) LDH₄ (HMMM) a LDH₅ (MMMM) podjednotka H a izoenzym LDH₁ (IUUH) v menší míře LDH₂ (НННМ), může jako substrát použít nejen laktát a pyruvát, ale α-hydroxybutyrát. To bylo základem návrhu na vyhodnocení aktivity LDH₁ v krvi, s použitím a-hydroxybutyrátu jako substrátu; zatímco isozym LDH₁ označované jako a-hydroxybutyrát dehydrogenáza (a-HBDG). Při infarktu myokardu poskytuje studie aktivity celkového LDH a α-HBDG podobné výsledky. Pokud se aktivita LDH v krvi zvýší v důsledku jiného patologického procesu, bude aktivita LDH významně vyšší než aktivita LDH.₁ a α-HBDG v nepřítomnosti dynamiky charakteristické pro infarkt myokardu.

Při infarktu myokardu nedošlo k žádné významné korelaci mezi aktivitou KK-MB a LDH.₁ ve všech termínech infarktu, který nastane jako výsledek významného rozdílu v dynamice a načasování zvýšení aktivity těchto isoenzymů v krvi.

Molekuly enzymů, které vstoupily do krve po smrti kardiomyocytů, jsou patologické složky krevní plazmy, a proto musí být odstraněny. V závislosti na velikosti markerových molekul se některé proteiny, například myoglobin, vylučují do moči nebo do fagocytárních buněk monocytového makrofágového systému. Předtím, než jsou molekuly CK-MB a CK-MM fagocytovány makrofágy, procházejí sekvenčním působením proteáz v krvi, což vede k tvorbě isoenzymů CK-MB a CK-MM.

V myocytech je izoenzym KK-MM reprezentován jedinou formou MM-3. V krvi karboxypeptidáza postupně odštěpuje konečné aminokyselinové zbytky lysinu z každého ze dvou monomerů a postupně tvoří izoformy MM-2 a MM-1. Stanovení izoforem KK-MM a KK-MB metodou EF a výpočet jejich poměru

až do 1 hodiny, aby se stanovil čas smrti kardiomyocytů. Poměr izoforem MM a MB se mění před vzrůstem aktivity KK-MB.

Enzymodiagnostika infarktu myokardu v klinických diagnostických laboratořích je složitá. Nejprve se stanoví aktivita AST, KK a LDH, poté se zkoumá aktivita KK-MB a LDH₁. Integrovaný přístup k diagnostice enzymů je zaprvé způsoben skutečností, že při zkoumání aktivity jediného enzymu může dojít k chybě; za druhé, každý z těchto enzymů se liší diagnostickým významem a dynamikou (doba výskytu v krvi a rychlost vylučování z cévního lůžka). Kromě nepřesností, které mohou být provedeny na preanalytické (odběr vzorků krve pro analýzu) a analytických fázích, existují objektivní důvody, které ovlivňují výsledky stanovení aktivity enzymů. Problémy vznikají, když se infarkt myokardu vyvíjí na pozadí závažných somatických onemocnění, s infarktem myokardu komplikovaným kardiogenním šokem, se septikémií.

Navzdory klinické specifičnosti aktivity QC pro infarkt myokardu (98%), v některých případech není možné zvýšit aktivitu QC a QC-MB ani v podmínkách ověření diagnózy infarktu myokardu podle EKG dat. K tomu dochází v případech, kdy se infarkt vyvíjí na pozadí selhání ledvin a hromadění uremických toxinů (středně molekulární peptidy), u pacientů s cirhózou jater a nedostatečnou detoxikační aktivitou hepatocytů, se septikemií a endogenní intoxikací, s výraznou metabolickou (respirační) acidózou. Za těchto podmínek se v krvi hromadí tak velký počet nespecifických inhibitorů, že aktivita QC a QC-MB je prakticky neurčena. V takových případech je možné stanovit aktivitu QC pouze po postupu ředění séra nepopulárního v klinické biochemii, kdy pokles koncentrace inhibitorů umožňuje projevit se aktivitu enzymu.

Přítomnost inhibitorů KK a KK-MB v krvi vedla k vývoji imunochemické metody pro stanovení katalytické aktivity v krvi, ale obsahu KK-MB molekulovou hmotností této formy. To významně zlepšilo citlivost metody a reprodukovatelnost výsledků. I když nekomplikovaný infarkt myokardu, aktivita KK-MB a obsah proteinu KK-MB dobře korelují,

je možné určit obsah QC-MB v krvi o několik hodin dříve, než je enzym aktivní. Významné zvýšení hladiny CK-MB proteinu v krvi bylo zaznamenáno u poloviny pacientů již po 3 hodinách a 6 hodin po ataku anginy pectoris byla u všech pacientů s klinickým obrazem infarktu myokardu zaznamenána vysoká hladina proteinu. Již 90 minut po trombolýze se hladina KK-MB proteinu v krvi několikrát zvyšuje. U pacientů s nestabilní anginou pectoris je pozorováno zvýšení obsahu CC-MB proteinu častěji než zvýšení aktivity isoenzymu. Současně, přes výrobu diagnostických sad různými společnostmi, nebyla konečně vyřešena otázka standardizace metody určování počtu QC-VM.

Hodnota glykogen fosforylázy. Mezi markery enzymů a isozymů v diagnostice infarktu myokardu určují klinické biochemici aktivitu GF a jeho izoenzymu GF-BB. GF je cytosolický enzym, který katalyzuje odstranění glukózy z glykogenu v buňce.

V lidských tkáních existují tři GF izoenzymy: GF-LL v játrech, GF-MM v myocytech a GF-BB v mozkové tkáni. V lidském myokardu existují izoenzymy GF-BB a GF-MM, v myocytech kosterních svalů - pouze GF-MM. GF-BB je nejcitlivějším testem pro diagnózu infarktu myokardu během prvních 3-4 hodin po ataku anginy pectoris. Podle diagnostické citlivosti v prvních hodinách lze stanovení aktivity GF porovnat pouze se stanovením hmotnosti KK-MB v krvi. U většiny pacientů hladina GF-BB významně vzrostla již po 4 hodinách po záchvatu anginy pectoris a nekomplikovaný infarkt myokardu se vrátil do normálu během 48 hodin.

Hodnota myoglobinu. Mezi proteinové markery infarktu myokardu patří nejrozšířenější definice v krvi k obsahu myoglobinu (MG). MG je chromoprotein, který v cytosolu všech svalových buněk transportuje kyslík hlavně do mitochondrií. Molekulová hmotnost MG je pouze 18 kD; jeho vlastnosti jsou podobné u myocytů kosterních svalů a kardiomyocytů. MG je neustále přítomen v krevní plazmě v koncentraci nižší než 80 ng / ml. Při infarktu myokardu stoupá hladina MG v krvi 10-20krát.

• Zvýšení MG v krvi - nejčasnější test pro diagnostiku infarktu myokardu; zvýšení hladiny MG v krvi lze stanovit po 3-4 hodinách po záchvatu anginy pectoris. Toto je první diagnostická hodnota MG.

• Druhým znakem MG v diagnóze infarktu myokardu je, že taková malá molekula volně prochází filtrační bariérou renálních těl a rychle končí v moči. To určuje povahu změn v obsahu MG v krvi: rychle stoupá a klesá stejně rychle. Pouze při stanovení MG je možné diagnostikovat opakované infarkty myokardu (obr. 4.2), které se vyvíjejí několik hodin po první epizodě smrti kardiomyocytů. Kromě toho bylo v řadě klinických pozorování pozorováno významné kolísání hladiny MG v krvi v první den infarktu myokardu, kdy výrazný nárůst v několika hodinách způsobil stejně výrazný pokles. Β V některých situacích zůstává hladina MG v krvi po dlouhou dobu neustále vysoká. To je pozorováno při kardiogenním šoku, kdy snížení kontraktilní funkce vede k hypotenzi, poklesu hydrostatického tlaku přes renální membránu a ukončení léčby.

Obr. 4.2. Dynamika koncentrace myoglobinu v krvi po opakovaném záchvatu anginy pectoris

glomerulární filtrace, kdy MG nelze filtrovat do moči. Současně existuje pozitivní korelace mezi obsahem MG v krvi pozitivně koreluje se zvýšením hladiny kreatininu.

Hlavní strukturní kontraktilní jednotka myocytů je sarkomér, který je tvořen řádně uspořádanými tlustými a tenkými vlákny. Tenká vlákna obsahují aktin a komplex troponin-tropomyosin.

Hodnota troponinu. Regulační komplex troponinu v pruhovaných svalech se skládá ze tří polypeptidů; V diagnostice infarktu myokardu je v krvi stanoven pouze obsah troponinu T (Tn T) a troponinu I (Tn I). Každý protein má tři izoformy, jejichž syntéza je kódována třemi různými geny. Izoformy myokardu Tn T a Tn I (srdce Tn T a srdce Tn I) se používají jako specifické markery smrti kardiomyocytů.

Stanovení obsahu Tn T umožňuje diagnostiku infarktu v časném i pozdním období. Obsah Tn T v krvi stoupá po několika hodinách po záchvatu anginy pectoris. V počátečních stadiích infarktu myokardu je klinická senzitivita stanovení obsahu myoglobinu a KK-MB vyšší než Tn T, ale od třetího dne dosahuje hladina Tn plató, která přetrvává s postupným poklesem po dobu 5-6 dnů. Hladina Tn se ukazuje jako vysoká v obdobích nekomplikovaného infarktu myokardu, kdy se hladina myoglobinu a aktivity KK-MB již vrátila k normálu a v krvi zůstává pouze vysoká aktivita LDH.₁. V některých případech, při stanovení Tn T, může být diagnóza infarktu myokardu provedena později - 8-10 dnů po anginální bolesti. Je obzvláště důležité vyšetřit TI u pacientů, kteří byli přijati do nemocnice 2-3 dny po záchvatu anginy pectoris, kdy indikátory KK a KK-MB se již mohou vrátit na původní úroveň. Ve srovnání s KK a KK-MB se obsah Tn T v krvi zvyšuje ve větší míře, což charakterizuje vyšší diagnostickou citlivost stanovení obsahu Tn T v krvi.

Srovnávací studie Tn T a Tn I odhalila vyšší diagnostickou senzitivitu Tn I. Hladina Tn I v krvi během infarktu myokardu tedy může být téměř 100krát vyšší než horní hranice normálu. S malým infarktem myokardu se hladina Tn I v krvi zvyšuje ve větší míře než aktivita CC,

Tabulka 4.1. Srovnávací charakteristiky markerů srdečního séra

a Procento nebo poměr QC-MB / celkem. QC 6 Doba od nástupu bolestivého záchvatu závisí na metodě

KK-MB a LDG₁. Stanovení obou forem Tn T a Tn I je preferováno v diagnostice infarktu myokardu, který se vyvíjí v pooperačním období a po aktivních resuscitačních opatřeních.

Neexistuje žádný ideální marker stavu kardiomyocytů (Tabulka 4.1). V diagnostice infarktu myokardu mají kliničtí biochemici tendenci používat nejvíce orgánově specifické izoenzymy a identifikovat proteinové markery obsahující pouze buňky myokardu. Nicméně, pro diagnózu infarktu myokardu v laboratořích nadále určovat a MG. S nekomplikovaným infarktem myokardu však dynamika nespecifického MG v krvi prakticky opakuje kardiošpecifickou CC-MB, která je 4-6 hodin před ním a zároveň nebyly úspěšné pokusy o stanovení obsahu MG v moči pro diagnózu infarktu myokardu.

4.2. ŽIVÉ CHOROBY

Navzdory mnoha biochemickým procesům v jaterních buňkách nemají všechny z nich diagnostickou hodnotu. To je dáno omezenými metodickými schopnostmi laboratoře, nízkou úrovní znalostí o patofyziologii jater a jednosměrnými změnami v řadě biochemických testů.

Dominantní hodnotou v laboratorní diagnostice onemocnění jater je stanovení aktivity enzymu. Enzymy syntetizované hepatocyty a epiteliálními buňkami žlučových cest mohou být rozděleny na indikátor, sekreci a vylučování. Sekreční enzymy zahrnují cholesterázu, její aktivita v krvi při onemocněních jater klesá v důsledku porušení její syntézy. Exkrečními enzymy zahrnují alkalickou fosfatázu, GGT a PAWS. Největší skupinou diagnosticky významných enzymů jsou indikátorové enzymy, včetně ALT, AST, LDH a GLDH. V záložce. 4.2 ukazuje uvedené enzymy a jejich intracelulární distribuci.

V diferenciální diagnóze onemocnění jater byla rozšířena metoda porovnávání stupně zvýšení aktivity enzymů s různou lokalizací v hepatocytech a odráží různé strany funkční aktivity buněčných lézí. Nejpoužívanější poměr enzymů je uveden v tabulce. 4.3.

Tabulka 4.2. Jaterní enzymy

Tabulka 4.3. Poměr jaterních enzymů

Pro onemocnění jater použijte koeficient De Ritis (poměr aktivity AST / ALT). Poměr AST / ALT vyšší než 2 je typický pro léze vyvolané alkoholem a nižší než 1 pro virovou hepatitidu a cholestatický syndrom. Ve většině případů virové hepatitidy zůstal poměr AST / ALT pod 1. U virové hepatitidy se aktivita ALT zvyšuje desetinásobně. V akutní alkoholické hepatitidě je aktivita AST vyšší než ALT, zatímco aktivita obou enzymů nepřesahuje 500-600 IU / L. Pacienti s toxickou hepatitidou, infekční mononukleózou, intrahepatickou cholestázou, cirhózou, jaterními metastázami, aktivitou myokardiálního infarktu AST jsou vyšší než aktivita ALT. Aktivita ALT a AST se zvyšuje při užívání erythromycinu, kyseliny para-aminosalicylové, diabetické ketoacidózy, psoriázy, je také používána pro časnou diagnózu anikterní hepatitidy.

V diferenciální diagnostice jaterní patologie je důležité zkoumat poměry aktivity izoenzymů LDH. Zvýšení relativní aktivity izoenzymu LDH₅ charakteristika lézí hepatocytů. LDH hyperfermentémie je pozorována v různých stupních u akutní virové, lékové a hypoxické hepatitidy, srdečního selhání, cirhózy jater a extrahepatické cholestázy, stejně jako snížení osmotické rezistence erytrocytů a hemolýzy. Dlouhodobé zvýšení aktivity izoenzymů LDH₅ a LDH₄ naznačuje přítomnost jaterních metastáz.

V současné době se v diagnostice onemocnění jater stále hodnotí stabilita koloidních systémů thymolem a sublimatickými testy. Patologické výsledky odrážejí časná období akutní hepatitidy, toxické poškození jater, exacerbaci chronické hepatitidy. Proteiny ESP v krevním séru také poskytují nespecifická data, ale umožňuje posoudit povahu patologického procesu. Procento albuminu, proteinů akutní fáze a γ-globulinů pomáhá v diagnostice jaterní patologie: nízký albumin a vysoké hladiny γ-globulinů jsou charakteristické pro cirhózu jater. Zvýšené hladiny γ-globulinů v krvi se také nacházejí v tukové infiltraci jater, zánětu žlučových cest a malignitě.

Obsah albuminu v séru má diagnostickou hodnotu u akutních a chronických forem hepatitidy. Ve všech případech akutní hepatitidy zůstává hladina albuminu v krvi normální.

Chronická hepatitida je doprovázena hypoalbuminemií a hypergamaglobulinémií.

Játra jsou ústředním článkem v regulaci srážení krve. Hepatocyty syntetizují fibrinogen, mnoho aktivátorů a inhibitorů kaskády enzymatických reakcí. Akutní i chronická hepatitida tuto regulaci narušují. Diagnostické testy onemocnění jater zahrnují prodloužení protrombinového času, akumulaci produktů destrukce fibrinogenu v krvi. Akutní poškození jater je doprovázeno zvýšeným krvácením v podmínkách hypofibrinogenemie.

Porucha funkce jater je doprovázena změnou metabolismu LP. Hypertriglyceridemie je charakteristická pro různé formy patologie jater. Hypercholesterolémie se často vyskytuje, když jsou žlučové kanály blokované a obstrukční žloutenka. Při chronické hepatitidě dochází k hromadění volného cholesterolu v krvi v důsledku snížení jeho esterifikace v krevním řečišti. Za podmínek výrazné cholestázy je pozorována tvorba cholestatických makroskopických forem LP-LP-X, které tvoří komplex LP s fragmentem plazmatické membrány.

Ve většině případů onemocnění jater zůstává etiologický faktor nad rámec diagnózy a klinické biochemici tvoří diagnózu založenou na principech syndromové diagnózy.

Hlavní patologické procesy, které tvoří laboratorní diagnózu onemocnění, jsou následující syndromy:

• intrahepatická a extrahepatická cholestáza;

• toxické léze hepatocytů;

• nedostatečnost syntetických procesů v hepatocytech;

• zpomalení inaktivace toxických sloučenin;

Syndrom cytolýzy. Patofyziologický základ syndromu cytolýzy je porušením integrity plazmatické membrány hepatocytů a jejich organel s rozvojem hyperfermentémie. Závažná hyperfermentémie, když cytosolické enzymy vstupují do krevního oběhu, je charakteristická pro infekční hepatitidu, léčivé a toxické poškození jater, otravu, dekompenzovanou cirhózu a perifokální zánět parenchymu u cholangitidy. V enzymatické diagnostice cytolýzního syndromu dominuje definice

Aktivity ALT, AST a LDH. Normálně aktivita ALT a AST v krvi nepřesahuje 24 IU / l; do 100 IU / L se hyperfermentémie považuje za „šedou zónu“, která může být způsobena reaktivními změnami v hepatocytech. Aktivita ALT nad 100 IU / l indikuje poškození jaterního parenchymu. Zvýšení aktivity ALT v 100-200 krát (až 2-6 tisíc IU / l) odráží rozsáhlé poškození hepatocytů ve virové hepatitidě a otravě organickými rozpouštědly.

Syndrom intrahepatické a extrahepatické cholestázy. Intrahepatický cholestázový syndrom určuje porušení odtoku žluči z jater. Zvýšení objemu hepatocytů vede ke kompresi žlučových cest, zhoršené drenážní funkci. Zjištění velkých žlučovodů je příčinou extrahepatické cholestázy; nejvýraznější cholestáza s obstrukční žloutenkou. V záložce. 4.4 ukazuje kombinaci laboratorních testů nejčastěji používaných pro diferenciální diagnostiku cholestázy.

Tabulka 4.4. Diagnóza cholestázy

Spolehlivé markery intrahepatického cholestázového syndromu jsou zvýšení aktivity ALP, GGT a 5-nukleotidázy v krvi. V epiteliální membráně žlučovodu jsou enzymy umístěny blízko u sebe, a proto se destrukce membrán zvyšuje jejich aktivita v krevním oběhu současně a rovnoměrně.

Reaktivní změny v epitelu žlučových cest a plazmatických membránách hepatocytů jsou hodnoceny na základě aktivity alkalické fosfatázy. Aktivita alkalické fosfatázy pomáhá v diferenciální diagnostice intrahepatické a extrahepatické cholestázy. Při extrahepatické obstrukci (kameny žlučových cest, novotvar papriky Vater) se aktivita alkalického fosforu zvyšuje 10krát nebo více. Intrahepatická obstrukce parenchymálních lézí (hepatitida) je doprovázena

je zvýšení aktivity alkalické fosfatázy o 2-3 krát. Akutní nekróza hepatocytů nemusí být doprovázena zvýšením aktivity alkalické fosfatázy, pokud to nezpůsobuje kompresi žlučových cest (intrahepatická cholestáza). Ne všechny patologické procesy v játrech pozorují závislost mezi aktivitou alkalické fosfatázy a hyperbilirubinemií. V časných stádiích intrahepatické cholestázy je zvýšení aktivity alkalické fosfatázy důsledkem aktivace její syntézy; další zvýšení je spojeno s destrukcí žlučových kanálků působením žlučových kyselin.

Syndrom intracelulární cholestázy. Zvýšení velikosti hepatocytů a jejich komprese žlučových cest mezi segmenty jater vede k výskytu intracelulárního syndromu cholestázy s mírným zvýšením aktivity alkalické fosfatázy a GGT v krvi a poškození epitelu žlučových cest. Zvýšení obsahu krve žlučových kyselin je také časným příznakem cholestázy.

Častým příznakem jaterního onemocnění doprovázeného cholestázou je akumulace bilirubinu v krvi. Závažnost hyperbilirubinemie je pro diferenciální diagnózu intrahepatických a extrahepatických cholestáz nespolehlivá. Hyperbilirubinémie má zároveň prognostickou hodnotu. Zvýšení hladiny bilirubinu je pětkrát typické pro intrahepatickou cholestázu, zvýšení koncentrace bilirubinu je desetkrát více charakteristické pro akutní hepatitidu.

Syndrom toxického poškození hepatocytů se vyvíjí například při intoxikaci alkoholem, kdy účinky cytolýzy chybí, ale alkohol porušuje funkci mitochondrií.

Při akutní intoxikaci alkoholem se vyvíjí syndrom toxického poškození subcelulárních formací a není narušena integrita plazmatických membrán v hepatocytech. Alkoholové metabolity mají toxický účinek, zejména acetaldehyd, který vzniká přímo v mitochondriích. Současně je v buňce narušena tvorba vysoce energetických sloučenin, zejména ATP, což má patologický vliv na detoxikační procesy toxických sloučenin. V akutním období alkoholické hepatitidy může dominovat aktivita AST v krvi v důsledku vysoké aktivity izoenzymu mitochondrií AST, nikoli cytoplazmy.

Zapojení hepatocytů do patologického procesu mitochondrií je doprovázeno výskytem aktivity GlDG v krvi. Zvýšená aktivita GlDG je časný alkoholický hepatitidový test, ale 8–10násobné zvýšení aktivity GlDG s mírnou aktivací AST a ALT je charakteristické pro obstrukční žloutenku. Pro toxické

Účinky alkoholu jsou charakterizovány výrazným zvýšením aktivity GGT v krvi bez významného zvýšení aktivity alkalického fosforu.

Syndromová nedostatečnost syntetických procesů se projevuje snížením syntézy hepatocytových transportních proteinů, proteinů systému srážení krve, CE.

HE a jeho izoenzymy syntetizují hepatocyty. Za podmínek parenchymální léze se snižuje syntéza ChE a její aktivita v krvi. Častěji dochází ke snížení krevního tlaku v důsledku toxických účinků (cytostatika, insekticidy, fungicidy, fluoridy). Fyziologický pokles aktivity ChE se projevuje během těhotenství. Jsou zaznamenány vzácné případy geneticky určeného snížení syntézy ChE.

U akutního selhání jater se u každého 4. pacienta vyvíjí hypoglykémie. Za podmínek akumulace intermediárních metabolitů a vývoje inzulínové rezistence je také možný výskyt hyperglykémie. Při dlouhodobém selhání jater dochází k hyperinzulinemii (snížení destrukce hormonu v játrech). Za podmínek hypoxie a aktivace anaerobní glykolýzy vzniká metabolická acidóza při hromadění kyseliny mléčné v krvi (laktátová acidóza). Metabolická acidóza vede k porušení poměru elektrolytů. Porážka jaterního parenchymu je doprovázena snížením tvorby kreatininu a močoviny. Přispívá k tomu samozřejmě nedostatečný příjem bílkovin a poruchy trávení. Hlavní příčinou hypokreatininémie je však snížení syntézy kreatininu v hepatocytech. U pacientů s hepatitidou je hypokreatininémie spojena se snížením hladiny kyseliny močové v krvi.

Syndrom zpomalení inaktivace toxických sloučenin je způsoben inhibicí jejich hydroxylace v mikrozomálním aparátu hepatocytů, což snižuje rychlost inaktivace v těle mnoha léčiv. Za těchto podmínek může i nízká terapeutická dávka léčiva způsobit výrazný vedlejší účinek.

Játra slouží jako biologická bariéra endogenních a exogenních toxických sloučenin, které primárně pocházejí z gastrointestinálního traktu. Posouzení detoxikační funkce jater je častěji prováděno s chronickými lézemi pomocí zátěžových testů s galaktózou, kyselinou fenoltetrabromftalensulfonovou, bromocyanovym greenem, značenými sloučeninami. Zátěžové testy poskytují příležitost diagnostikovat chronické formy onemocnění, hodnotit

zbytkové účinky přenesené hepatitidy, vytvořit představu o funkci jater v cirhóze, tukové infiltraci jater.

V těžkých situacích jaterní kómy s akutní virovou hepatitidou nebo portální hypertenzí je detoxikační funkce jater hodnocena na základě množství amoniaku v krvi. Tvorba čpavku ve střevech se neustále objevuje v důsledku vitální aktivity mikroorganismů a deaminace aminokyselin vytvořených z potravinových proteinů. Uprostřed masivního krvácení ze žaludku nebo žil jícnu dochází ke zvýšené tvorbě amoniaku z krevního albuminu.

Zánětlivý syndrom je způsoben aktivací buněk RES. Vyznačuje se zvýšením krevního obsahu proteinů akutní fáze, dysproteinemií v rozporu s poměry proteinů v séru na elektroforegramu, změnou vzorků sedimentů (thymol), zvýšením koncentrace imunoglobulinů.

Navzdory různorodosti těchto poruch je použití syndromních diagnostických metod účinné již v raných stadiích onemocnění jater. Výsledky biochemických studií v diagnostickém procesu nejsou přirozené. Současně kliničtí lékaři využívají údaje z anamnézy a fyzikálního vyšetření, výsledky radionuklidové diagnostiky, výpočetní tomografie a biopsie jater. Diferenciální diagnostika v raných stadiích onemocnění a hodnocení povahy poškození hepatocytů může být prováděna pouze na základě laboratorních testů, především údajů z klinické biochemie. Použité kombinace laboratorních studií jsou uvedeny v tabulce. 4.5.

Tabulka 4.5. Diagnostika onemocnění jater enzymy

4.3. PATHOLOGIE KOSTNÍ TYČKY

Mezi hlavní faktory ovlivňující metabolismus fosforečnanů a vápníku patří PTH, kalcitonin a vitamín D. PTH a kalcitonin si udržují stálost vápníku v cévním lůžku a extracelulární tekutině, ovlivňují absorpci vápníku ve střevě, reabsorpci v ledvinách, střevech a ukládání v kostní tkáni. PTH reguluje vápník v krvi, ovlivňuje absorpci vápníku ve střevě a renálních tubulech, mobilizaci vápníku z kostní tkáně. Kalcitonin má méně významný účinek, snižuje aktivitu osteoklastů, zvyšuje aktivitu osteoblastů, což vede ke snížení vápníku v krvi.

PTH je polypeptid, jehož jediný řetězec sestává z 84 aminokyselinových zbytků. Hormon vylučuje příštítné tělísky, pravděpodobně ve formě neaktivního prekurzoru, ze kterého je aktivní hormon tvořen štěpením polypeptidového fragmentu. Aktivní PTH má krátký poločas rozpadu, což způsobuje problémy při analýze: pomocí radioimunoanalýzy se hlavně měří karboxyterminální fragment hormonu, který má delší poločas rozpadu, ale je biologicky neaktivní.

Při působení na ledviny PTH potlačuje reabsorpci fosforu v proximálních a distálních tubulech nefronu, zvyšuje jeho vylučování a tím snižuje hladinu fosforu v krvi (hypofosfatemii). Hormon zároveň zvyšuje reabsorpci tubulárního vápníku, zejména v distálních tubulech nefronu. Účinek PTH v kostní tkáni způsobuje mobilizaci vápníku a fosfátu, což přispívá k výskytu osteoporózy a hyperkalcémie. Negativní zpětná vazba hypokalcémie je hlavním stimulem pro sekreci PTH, zatímco hyperkalcémie potlačuje tvorbu hormonu příštítnými tělísky. PTH také zvyšuje absorpci vápníku a fosforu ve střevě, což stimuluje syntézu 1,25-dihydroxycholekalciferolu.

V případech hypersekrece PTH s paratyroidním adenomem se vyvíjí výrazná osteoporóza s přítomností t

hyperkalcémie a hypofosfatémie a zvýšené vylučování vápníku a fosfátů v moči. Za těchto podmínek je inhibována reabsorpce fosfátů v tubulech a v důsledku toho je jeho vylučování zvýšeno, clearance fosfátů je zvýšena s výskytem hyperkalcémie v podmínkách kostní resorpce s rozvojem osteoporózy. Diagnózu můžete potvrdit stanovením koncentrace PTH v krvi. V případech, kdy je hypofosfatémie doprovázena hyperkalcémií, je diagnosticky důležité i mírné zvýšení obsahu hormonů.

Je třeba mít na paměti, že v některých formách nádorů plic, ledvin, vaječníků dochází v nádorových buňkách k tvorbě ektopického PTH. Mezi těmito stavy je nutné rozlišovat formu křivice rezistentní na vitamin D. Toto vzácně se vyskytující dědičné onemocnění spojené se sexem se nazývá Fanconiho syndrom. Tato látka se vyznačuje vysokým vylučováním fosforu v moči současně s glukosurií a aminoacidurií bez výskytu acidózy v krvi.

U chronického selhání ledvin může dojít k aktivaci syntézy PTH jako kompenzačního mechanismu ve vývoji hypokalcémie a hyperfosfatemie. Sekundární hyperparatyreóza je také pozorována u osteomalacie, která je způsobena významným snížením absorpce vápníku ve střevě se zvýšeným vylučováním.

Tento patologický stav se nejčastěji vyvíjí jako komplikace operace štítné žlázy, kdy se omylem odstraní příštítné tělísky. V tomto případě je hladina vápníku v krvi tak nízká, že se vyvíjejí specifické symptomy hypokalcémie a hyperfosfatémie (symptomy Khvostek a Trusso), vylučování vápníku a fosforu močí se snižuje. Tento stav vyžaduje okamžité intravenózní podání chloridu vápenatého.

V klinickém obrazu pseudo-hypoparatyreoidismu je změna hladiny fosfátů a vápníku v krvi podobná změnám primární hypoparatyreózy, ale zároveň se zvyšuje obsah PTH v krvi. Tento stav

charakteristika genetického onemocnění (Albrightova choroba) spojeného s neschopností renálních tubulárních buněk reagovat na hormon.

Druhým hormonem, který reguluje metabolismus fosforu a vápníku, je kalcitonin. Jednořetězcový peptid s 32 aminokyselinovými zbytky vylučuje parafolikulární buňky laterálních laloků štítné žlázy. Tento hormon inhibuje mobilizaci fosfátů a vápníku, zatímco jejich obsah v krvi klesá (hypokalcémie a hypofosfatémie). Účinek hormonu na ledviny není dobře znám; Doporučuje se, aby kalcitonin zvyšoval tubulární vylučování fosfátů. Hormon navíc inhibuje stimulační účinek PTH na syntézu 1,25-dihydroxyhaloalkalciferolu.

ÚLOHA VITAMINU D

Třetí faktor aktivně ovlivňující metabolismus vápníku a fosforu v kostní tkáni je vitamin D. Syntéza vitamínu D v těle probíhá ve dvou fázích hydroxylace: první se vyskytuje v játrech za vzniku látky s omezenou biologickou aktivitou; druhá fáze se vyskytuje v ledvinách s tvorbou vitamínu D₃, cholekalciferol s maximální biologickou aktivitou. Vitamin D v tenkém střevě₃ stimuluje absorpci fosforu a vápníku, v proximálních částech tubulární části nefronu aktivuje reabsorpci obou iontů. Faktory, které aktivují syntézu vitamínu D₃ v ledvinách je pokles obsahu fosforu v krvi a účinek PTH.

V podmínkách nedostatku vitamínu D, v důsledku snížení obsahu jeho prekurzorů rozpustných v tucích v potravinách, nedostatečného ultrafialového záření kůže nebo malabsorpce, je v krvi zaznamenána výrazná hypofosfatémie. V reakci na zvýšení sekrece PTH, absorpce vápníku a fosfátů v tenkém střevě a mobilizace minerálů z kostní tkáně vzrůstá. V průběhu času to normalizuje obsah vápníku v krvi, ale koncentrace fosforu může zůstat snížena v důsledku inhibice jeho reabsorpce parathyroidním hormonem.

U chronického selhání ledvin se vyvíjí syndrom renální osteodystrofie - komplexní porušení metabolismu kostní tkáně a homeostázy fosforu a vápníku. Snížení glomerulární

filtrace produkuje hyperfosfatemii, hypokalcémie se vyvíjí s poklesem syntézy vitaminu D v ledvinách a rezistence na jeho účinky. Hyperfosfatemie může přispět k rozvoji hypokalcémie v důsledku snížení absorpce vápníku v tenkém střevě v důsledku tvorby nerozpustných apatitů.

CHOROBY TABULE METABOLICKÝCH KOSTÍ

Vlastní metabolická onemocnění kostí jsou rozdělena na osteoporózu, osteomalacii, osteodystrofii, osteogenezi imperfecta a osteoporózu. Onemocnění kostí se také může vyvíjet na pozadí jiné patologie, jako je akromegálie nebo ektopická kalcifikace v cévní stěně (s aterosklerózou a normálně s tvorbou "mozkového písku" v epifýze).

Osteoporóza je nejčastější metabolické onemocnění kostí. Osteoporóza je typická pro mnoho onemocnění, charakterizovaných generalizovanou ztrátou kostní tkáně, která překračuje věkové a pohlavní standardy a vede ke snížení pevnosti kostí, což způsobuje náchylnost ke zlomeninám (spontánní nebo s minimálním poraněním). Osteoporóza by měla být odlišena od osteopenie (atrofie kostní tkáně související s věkem) a osteomalacie (zhoršená mineralizace kostní matrix).

Mezi rizikové faktory osteoporózy patří příslušnost k rodu Caucasoid nebo Mongoloid, predispozice rodiny, tělesná hmotnost nižší než 58 kg, kouření a alkoholismus, nízká nebo nadměrná tělesná aktivita, časná menopauza, pozdní nástup menstruace, amenorea a neplodnost, prodloužená laktace (více než 6 měsíců) více než tři těhotenství a porod v reprodukčním věku, stejně jako zneužívání kávy (více než pět šálků denně), nedostatek vápníku z potravy a prodloužená parenterální výživa.

Klinický obraz se ve většině případů vyvíjí postupně, obvykle během několika let. V laboratorní diagnostice je důležité stanovit hladinu alkalické fosfatázy (může se přechodně zvýšit po zlomeninách), vápníku a fosfátů (obvykle normální). Aktivita kostní resorpce je určena poměrem hladiny vápníku v moči k hladině kreatininu v moči a poměru obsahu hydroxyprolinu v moči k hladině kreatininu v moči. Rentgenové vyšetření páteře odhalí snížení hustoty kostí s akcentací

kortikální kontury. Vzhled těchto odchylek na rentgenovém snímku je možný pouze se ztrátou alespoň 30% kostní tkáně.

Osteomalacie je kosterní patologie, která se vyskytuje, když organická matrice kostí není dostatečně mineralizována. U dětí jde o křivici (viz níže) u dospělých, metabolické poruchy vápníku, fosforu a vitamínu D.

Rachitida - onemocnění raného dětství, které je důsledkem nedostatku vitaminu D, charakterizované změnami v kostní tkáni s rozvojem skeletálních deformit. Všechny patofyziologické procesy jsou způsobeny hypokalcémií v důsledku nedostatku vitaminu D a jeho metabolitů. Kompenzační aktivace příštítných tělísek a hyperprodukce PTH, která mobilizuje vylučování vápníku z kostí a zvyšuje absorpci vápenatých a fosfátových solí ve střevě. Vyskytují se hypofosfatémie, metabolická acidóza a poruchy osteogeneze.

Deformující osteodystrofie (deformace osteitidy, Pagetova choroba) je dědičné onemocnění charakterizované deformací femorálních a tibiálních kostí, páteře a lebky s těžkou hyperostózou, zahušťováním a zakřivením kostí, zvýšeným výskytem nádorů. Obvykle se vyskytuje ve věku nad 50 let. Klinický obraz je obvykle asymptomatický, nejčastějším projevem je bolest v kosti nebo kloubu. Vzácněji jsou zaznamenány deformity kostí, bolesti hlavy, patologické zlomeniny, zvýšení tělesné teploty nad postiženou končetinou, srdeční selhání s vysokým srdečním výdejem a různé neurologické poruchy způsobené kompresí nervové tkáně (s poškozením lebky, z nichž nejčastější jsou hluchota). Laboratorní charakteristika je zvýšení alkalického fosforu a osteokalcinu v osteosclerotické fázi, zvýšení hladiny hydroxyprolinu v osteolytické fázi. Sérový vápník a fosfor jsou obvykle normální.

Renální nebo uremická osteodystrofie je běžné poškození kosti podobné osteomalacii, křivici nebo fibrózní osteitidě; při chronickém selhání ledvin.

Albrightova dědičná osteodystrofie je způsobena rezistencí cílových buněk vůči působení PTH (pseudohypoparathyroidismus). Pacienti s pseudohypoparathyroidismem jsou rezistentní na jiné hormony působící prostřednictvím systému adenylát cyklázy.

(hormon stimulující štítnou žlázu, glukagon, FSH, LH). U těchto pacientů je pozorován charakteristický fenotyp, který se projevuje brachydakticky krátkým vzrůstem, subkutánní osifikací. Albrightova choroba je často kombinována s diabetes mellitus, arteriální hypertenzí, obezitou, menstruačními poruchami (oligomenorrhea), arteritidou, polyartrózou. Také charakterizován mentální retardací a křečemi (v důsledku hypokalcémie).

Nedokonalá osteosyntéza je dědičné onemocnění, které způsobuje pokles kostní hmoty (v důsledku porušení osteogeneze) a způsobuje jejich zvýšenou křehkost; často doprovázena modrým zabarvením skléry, anomáliemi zubů (nedokonalá dentinogeneze) a progresivní ztrátou sluchu. Ultrazvuk odhaluje těžké formy plodu od 16. týdne těhotenství. Diagnóza je možná pomocí studií DNA ve vzorcích biopsie choriových klků. Symptomatická a ortopedická léčba.

Osteoporóza a osteoskleróza jsou kolektivní a v praxi identické koncepty charakterizující relativní nárůst obsahu kostní tkáně v kostech, což vede ke snížení objemu dutin kostní dřeně s nevyhnutelným poškozením hemopoézy.

Mramorová choroba. Je známo několik zděděných forem: dominantní dědičná Albers-Schoenbergova choroba a recesivní formy jsou maligní, benigní a letální formy. Frekvenční všechny formy - přibližně 1: 20.000 Klinicky osteopetrózy v této patologie se projevuje několik zlomenin, osteomyelitidu, hyperostózy lebku, chronické rýmy kvůli zúžení nosních průchodů, hepatosplenomegalie (způsobené vyrovnávací extramedulární krvetvorby), lícního nervu obrnou, anémie (způsobený poklesem objemu kostní dřeně) a laboratorní - zvýšením hladiny alkalické fosfatázy.

4.4. ZNAČKY RŮSTU MALIGNANTŮ

Není pochyb o tom, že úspěch léčby rakoviny lze očekávat pouze tehdy, když jsou maligní tumory detekovány v raném stádiu vývoje, nicméně otázka včasné detekce příznaků těchto patologií je stále otevřená.

V posledních letech se významně rozšířily diagnostické schopnosti klinických onkologů v souvislosti s využitím moderních instrumentálních diagnostických metod: angiopatie a lymfografie, radionuklidové diagnostiky, počítače

termografické a rentgenové tomografy, radio-magnetická rezonance, ultrazvuk s Dopplerovým efektem, který umožňuje získat barevný obraz nádoru a posoudit vlastnosti mikrocirkulace. Moderní imunomorfologické a cytologické studie umožňují studovat bioptické vzorky nejen samotného nádoru, ale také různých sekrecí (sputum, moč, ascitická tekutina). V současné době je komplexní laboratorní biochemická a imunologická diagnostika založena na identifikaci nádorových markerů, hormonů, biologicky aktivních sloučenin, enzymových izoforem a metabolitů kostní remodelace v případě metastatických kostních lézí.

Začátek studie nádorových markerů byl velmi povzbudivý. Již na konci 19. století byly v moči pacientů s mnohočetným myelomem nalezeny specifické proteiny (imunoglobuliny), které se nazývají Bens-Jonesovy proteiny, ale další úspěch musel čekat více než 80 let. To je spojeno s objevem GI. Abelev a Yu.S. Tatarin α-fetoprotein v krvi pacientů s hepatomem. Tyto studie znamenaly začátek nové etapy ve studiu faktorů spojených s růstem zhoubných nádorů a ve dvacátém století vedl k objevu řady různých sloučenin, nazývaných „nádorové markery“. Markery jsou široce používány klinickými biochemiky k identifikaci primárního nádoru a jeho metastáz. Markery maligního růstu zahrnují látky různé povahy. Mezi ně patří více než 200 sloučenin: antigeny, hormony, enzymy, glykoproteiny, lipidy, proteiny, metabolity, jejichž koncentrace koreluje s hmotou tumoru, jeho proliferační aktivitou a v některých případech se stupněm malignity novotvaru. Abnormální exprese genomu je jedním z hlavních mechanismů produkce markerů nádorovými buňkami, který určuje syntézu embryonálních, placentárních a ektopických proteinů, enzymů, antigenů a hormonů.

Jako ideální test pro časnou diagnózu maligních nádorů bylo navrženo mnoho markerů, ale dosud nebylo nalezeno žádné řešení. Obtíže vyplývající z rozmanitosti požadavků na ideální marker. Ideální nádorový marker by měl být produkován nádorovou buňkou v dostatečném množství, aby mohl být stanoven pomocí moderních metod. Neměl by být přítomen u zdravých lidí au benigních nádorů,

marker by měl být detekován v raných stadiích nádorového procesu, počet nádorových markerů by měl být přímo úměrný objemu nádoru, tento marker by měl být stanoven před klinickými projevy nádoru, hladina ideálního markeru by měla korelovat s výsledky protinádorové léčby.

V klinických studiích se používá řada dostatečně účinných nádorových markerů, které však ne vždy splňují všechna výše uvedená kritéria. Moderní biochemické a imunologické metody mohou odhalit nádory, když podmíněný počet nádorových buněk dosáhne 109 až 1010 a minimální hladina markeru vylučovaného nádorem je od jednoho do několika femtomolů (všechny údaje jsou založeny na 1 ml krevního séra). Vysoká účinnost použití nádorových markerů na klinice může být dosažena kombinací různých testů. Je třeba poznamenat, že počet navrhovaných markerů pro diagnostiku a monitorování zhoubných nádorů neustále roste a dochází k fázi kritického přehodnocení s cílem vytvořit strategii a adekvátní použití.

4.4.1. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ ZKUŠEBNÍCH ZNAČEK

Stanovení koncentrace nádorových markerů v různých novotvarech vyžaduje znalost faktorů, jak in vivo, tak in vitro, které ovlivňují výsledky nebo je zkreslují. To by mělo být rovněž zohledněno nejen u laboratorních lékařů, ale také u lékařů, kteří jsou přímo zodpovědní za proces pozorování a léčby konkrétního pacienta. Hlavní faktory ovlivňující definici nádorových markerů jsou následující.

• stupeň exprese a syntézy markeru;

• uvolnění markeru nádorovými buňkami;

• léky a chemoterapeutika;

• vylučování z těla;

• intenzita prokrvení nádoru;

• Poloha těla pacienta během krevního vzorku;

• instrumentální a ne přístrojové vyšetřovací metody (například bronchoskopie nebo biopsie);

• katabolismus nádorového markeru (například funkční stav jater a ledvin);

• špatné návyky (kouření, pití alkoholu). In vitro:

• podmínky skladování vzorků;

• časový interval mezi odběrem krve a centrifugací (se separací séra);

• stupeň hemolýzy a žloutnutí;

• kontakt nádob na odběr krve s kůží;

• kontaminace vzorku slinami;

• vliv drog;

• přítomnost protilátek proti myším imunoglobulinům v krvi pacientů (po diagnostické imunoscintigrafii a imunoterapii);

• metodická chyba při stanovení nádorového markeru. Je třeba vzít v úvahu, že většina cirkulujících

markery krevního tumoru jsou nevhodné pro screening pacientů v nepřítomnosti symptomů, protože existuje řada omezení spojených s často nízkou diagnostickou senzitivitou a specificitou, jakož i omezenou prediktivní hodnotou. Současně existuje řada rozpoznaných případů, kdy je obtížné zvládnout bez definice nádorových markerů.

Jedná se především o hodnocení účinnosti léčby. V počátečních stadiích mohou změny koncentrace nádorového markeru ukázat, zda vybraná chemoterapie bude úspěšná, nebo (v případě trvalého zvýšení koncentrace) je nutná korekce léčby až do zrušení. Testování nádorového markeru je v případě závažných případů rakoviny naprosto zbytečné.

Za druhé, sledování průběhu onemocnění. Použití nádorových markerů pro sledování průběhu novotvaru často umožňuje detekovat metastázy a / nebo recidivu nádoru po dobu 3-5 měsíců nebo více před klinickými projevy onemocnění. U některých pacientů může testování nádorových markerů po chirurgickém odstranění primárního místa nádoru poskytnout citlivější monitorování než endoskopii, ultrasonografii nebo počítačovou tomografii. Míra zvýšení hladiny tumoru

marker obvykle umožňuje učinit závěr o řadě pozorování

0 charakter progrese onemocnění, zejména o metastázách. Znalost povahy změn hladiny nádorového markeru také umožňuje optimalizovat dobu následného podrobného vyšetření pacienta. Při zachování nízké nebo normální hladiny nádorového markeru po dostatečně dlouhou dobu se zdá, že následné vyšetření, včetně invazivních nebo drahých technik, je nadbytečné. Naopak, pokud se zvyšuje úroveň nádorových markerů a informace o progresi onemocnění jsou nezbytné při rozhodování o taktice léčby, jsou tyto studie ukázány.

Za třetí, identifikace zbytkových a rekurentních nádorů. Nedostatečný slabý pokles hladiny nádorového markeru nebo nepřítomnost snížení obecně indikuje neúplné odstranění nádoru nebo přítomnost více nádorů (metastáz). Informace tohoto druhu mohou mít terapeutický a prognostický význam.

A konečně čtvrtá, predikce průběhu nádorového procesu. Jedná se o mimořádně intenzivně se rozvíjející moderní oblast aplikace nádorových markerů, zejména těch, jejichž výzkum souvisí s prognózou, a proto primárně ovlivňuje volbu terapie.

4.4.2. COLORECTAL CANCER

V evropských zemích onemocní kolorektální karcinom (CRC)

1 z 20 lidí. Méně obyčejně, tento druh rakoviny je nalezený v Africe a částech Asie. Nyní v Rusku se míra detekce CRC monotónně zvyšuje.

V současné době je použití molekulárních metod v diagnostice CRC považováno za velmi slibnou a důležitou oblast výzkumu, což je dáno tím, že události vyskytující se na úrovni genomu by měly být považovány za klíčové pro výskyt a progresi těchto nádorů. Existuje řada spolehlivých skutečností, které naznačují, že CRC v raných stadiích vývoje může a musí být identifikován molekulárními metodami. Metody molekulární diagnostiky CRC vám také umožňují předepisovat adekvátní léčbu a přesně předpovědět výsledek.

CRC se vyvíjí v důsledku postupných změn (dysplazie / adenom-adenokarcinom), které jsou založeny na genetické t

porušení. Mechanismy zodpovědné za výskyt a akumulaci těchto poruch v epitelové buňce však nejsou plně známy. Příkladem obtíží při studiu tohoto problému je skutečnost, že existují rozdíly ve frekvenci výskytu benigních a maligních fází onemocnění, a to v sekvenci dysplazie / adenomu-adenokarcinomu. Bylo prokázáno, že kolorektální adenomy se vyskytují ve více než polovině populace v 9. desetiletí života a CRC se vyvíjí pouze u 5% populace. V důsledku toho se pouze několik z prekancerózních změn transformuje na rakovinu.

Spolu se stáří a chronickými zánětlivými onemocněními (ulcerózní kolitida, Crohnova choroba nebo postižení tlustého střeva se schistosomiázou) je CRC v krevních příbuzných uznávaným, ne-li hlavním rizikovým faktorem. Příčiny, které způsobují CRC u jednoho člena rodiny, se mohou lišit od vzácných autosomálně dominantních syndromů s vysokým výskytem CRC (familiární adenomatózní polypóza, dědičný nepolypousní CRC syndrom) až po méně geneticky jasné podmínky, jako je například detekce adenomu v nejbližším okolí. příbuzní (rodič, sourozenec nebo dítě). Je známo, že se CRC objevil v mladším věku, čím vyšší je statistické riziko jeho výskytu u blízkých příbuzných. Dědičné syndromy CRC jsou uvedeny v tabulce. 4.6 podle fenotypu a mutací v příslušných genech.

Je třeba poznamenat, že studium molekulárních mechanismů, které jsou základem vzácných dědičných syndromů, přispělo k pochopení patogeneze sporadické CRC, která je v populaci pozorována mnohem častěji, ale na základě podobných nebo podobných molekulárních příhod.

Úloha molekulárně genetických poruch ve vzhledu CRC a zejména nestability genomu byla v poslední době intenzivně studována. V roce 1993, mikrosatelitová nestabilita (MSI) byla nalezená u členů rodiny s dědičným non-koloniální rakovina tlustého střeva (RTC). Tento objev sloužil jako základ pro hypotézu mutantního fenotypu rakoviny, kterou Loeb popsal, podle které musí buňka přežít různé mutace, aby se stala rakovinnou. Ale pro to by měla mít zpočátku schopnost mutovat častěji než obvykle, a to zase může

Tabulka 4.6. Dědičné syndromy CRC

Tabulka 4.7. Typy genetických poruch a molekulárních markerů v CRC

být spojen s inaktivací mechanismů odpovědných za normální uchování struktury DNA.

Téměř ve všech případech RTK je zaznamenána buď nestabilita chromozomů nebo nestabilita MSI. Ve skutečnosti existuje inverzní vztah mezi těmito dvěma porušeními. Maligní nádory, které mají MSI nestabilitu, jsou obvykle diploidní a nemají chromozomální aberace. Nádory s chromozomální nestabilitou jsou charakterizovány aneuploidií a jsou často doprovázeny ztrátou nebo výskytem dalších chromozomů. Častá detekce nestability chromozomů nebo nestability MSI v tomto případě nenaznačuje, že se jedná o velmi běžný a nespecifický jev v procesu vzniku jakéhokoliv maligního nádoru, ale že nestabilita genomu je úzce spojena s tumorogenezí.

Jak v chromozomální nestabilitě, tak v nestabilitě MSI lze detekovat v rané fázi RTK. S použitím komparativní hybridizace genomu pro stanovení průměrného počtu chyb během kopírování jsme tedy dokázali ukázat jejich postupné zvyšování s progresí adenomu s mírnou dysplazií na adenom s těžkou dysplazií a následnou transformací na rakovinu (tabulka 4.8).

Tabulka 4.8. Chromozomální nestabilita v případě RTK

U pacientů s vrozenou predispozicí způsobenou poruchami genů APC, včetně poruch nukleotidové sekvence a genové exprese, se vyvíjejí tumory, které se obvykle vyvíjejí jako výsledek nestability chromozomů, která je charakterizována ztrátou alel a cytogenetickými poruchami. U některých pacientů se sporadickým CRC se nádory vyskytují stejným způsobem.

Naproti tomu u pacientů s dědičným nepolipozním CRC syndromem mají mutace v genech korigujících chyby DNA za následek nádory charakterizované nestabilitou MSI a nukleotidy detekovanými jako opakované nukleotidové sekvence, z nichž některé jsou umístěny v kodonech genů. Zřídka je pozorována ztráta alel. Tento typ molekulární patologie je také pozorován v přibližně 15% případů sporadické CRC a je často spojován s anatomickými rysy, jako je umístění v proximálním střevě (vzestupné tlusté střevo); nízká diferenciace nádorových buněk s hlenem, medulární nebo crikoidní buněčnou složkou; přítomnost významného počtu lymfoidních folikulů s germinálními centry na periferii nádoru; infiltrace lymfocytů.

Neefektivní transkripce genů v důsledku odchylné methylace cytozových guaninových sekvencí (C-G ostrovy) v promotorových oblastech genů je v současné době považována za jednu ze složek molekulární patogeneze třetího poddruhu CRC.

Využití molekulárně diagnostických metod u pacientů má velký potenciál jak v časné diagnostice, tak i v hodnocení nádorové odpovědi na léčbu a v prognóze onemocnění. Jak je uvedeno v tabulce. 4.9 s takovou diagnózou můžete použít různé předměty studia.

U pacientů, kteří již mají CRC, mohou být molekulární metody použity k identifikaci mikrometastáz, k přesnějšímu posouzení stadia nádorového procesu, zejména k detekci mikrometastáz v lymfatických uzlinách, nebo k vyhodnocení možného hematogenního šíření nádorových buněk v kostní dřeni.

Molekulární diagnostika má navíc velký potenciál pro detekci genotypových a fenotypových charakteristik nádoru, které určují celý řetězec událostí vedoucích k buněčným metastázám, tzv. Metastatickým

Tabulka 4.9. Využití metod molekulární diagnostiky pro CRC

genotyp a fenotyp. Markery tohoto typu by mohly indikovat větší pravděpodobnost progrese nádorového procesu po radikální operaci.

Byly identifikovány genetické abnormality spojené s predikcí nebo odpovědí na chemoterapii pro CRC, včetně ztráty alely při 18q, vymizení exprese genového produktu DCC, abnormalit v genu p53, ztráty alel na krátkém rameni chromozomů 1 a 5, mutací RAS. Studie klinické účinnosti použití takových molekulárních markerů byly přesvědčivě formulovány, jsou v současné době prováděny a zahrnují reprezentativní vzorek populace. Pro široké využití v klinické praxi musí studie molekulárních markerů splňovat všechny požadavky na rutinní laboratorní testy, jako je reprodukovatelnost, dostupnost a odpovídající kontrola kvality. Konečně, výsledky studií molekulárních markerů by měly být snadno interpretovány kliniky a měly by mít terapeutickou hodnotu.

Složitost a vícestupňové genetické a biochemické procesy probíhající v rakovinných buňkách, které jim umožňují metastázovat, ztěžují interpretaci hodnot těchto markerů. Kromě toho faktory, které přímo nesouvisejí s nádorem, jako je kvalita chirurgické techniky, významně ovlivňují konečný výsledek. Mezi geny nádorových markerů, které předpovídají terapeutickou odpověď, byla pozornost zaměřena na p53 a geny regulované apoptózou, které jsou regulovány p53.

Jednou z oblastí molekulárně genetických studií nádorů je identifikace molekulárních poruch charakteristických pro pozdější vývoj metachronních nádorů, někdy mylně považovaných za opakování hlavního nádoru. Tyto studie zahrnují studii kolorektálních adenomů jako cíle pro identifikaci markerového genu z důvodu jejich vysoké frekvence v populaci jako prekancerózní změny ve srovnání s nízkou četností detekce maligních nádorů. Molekulární marker indikující vysokou pravděpodobnost rozvoje metachronních adenomů, zejména adenomů, schopných transformace na maligní nádor, by mohl být užitečný pro identifikaci rizikových skupin pro následné kolonoskopické vyšetření.

Naopak pacienti, u kterých je nepravděpodobné, že by metachronní adenomy postupovali, mohou být z screeningu vyloučeni. Strategie odstranění adenomu ukázala, že je spojena se snížením frekvence CRC a molekulární markery, které identifikují pacienty s vyšším rizikem, by mohly být užitečné.

Studie vzorků stolice a krve má také velký potenciál. Použití velmi jednoduchého testu na skrytou krev ve stolici tak snížilo úmrtnost na CRC, ale jeho specificita zůstává relativně nízká. Molekulární testy detekce fragmentů nádorové DNA ve výkalech jsou progresivnější. Řada studií ukázala, že DNA obsahující mutace mohou být identifikovány ve výkalech a krvi pacientů, kteří mají nádory s těmito mutacemi. Diagnóza nádorů, screening a dynamické pozorování pacientů se může výrazně zlepšit, pokud se překonají určité technické obtíže a jejich náklady jsou vyvážené.

V současné době výzkumníci věnují velkou pozornost studiu možností využití molekulárně genetických markerů CRC. Níže je stručná charakterizace nádorových markerů, které jsou v klinické praxi nejčastěji používány.

Poprvé byl rakovinový embryonální antigen (CEA) objeven v roce 1965 Goldem a Freedmanem ve studii lidské gastrointestinální tkáně a adenokarcinomu tlustého střeva. Později byla v séru pacientů s CRC detekována CEA. Tyto první práce byly velmi povzbudivé. Pak se zdálo, že mnozí zjistili

vysoce specifický test diagnózy RTK. Nicméně později, jak se zlepšily metody detekce CEA a akumulace klinických dat, tento marker byl také schopen izolovat se u jiných nádorů (rakovina pankreatu, jater, plic, štítné žlázy a neuroblastomu), stejně jako u neneoplastických onemocnění (cirhóza jater, ulcerózní kolitida, pankreatitida, chronická bronchitida, emfyzém, virová hepatitida, divertikulitida, polypy, selhání ledvin). Proto je nemožné při detekci CEA naprosto přesně říci, že pacient má tento typ rakoviny. Současně je CEA stále markerem první volby pro CRC a používá se s vysokou účinností při monitorování onemocnění, ale hlavní pozornost je věnována kvantitativním parametrům metody.

U 99% zdravých lidí je hladina CEA nižší než 5 ng / ml. S CRC se citlivost testu pohybuje od 25 do 80% a závisí na velikosti a stupni diferenciace nádoru, stejně jako na rozsahu procesu. Hladina CEA koreluje se stádiem nádorového procesu. Podle souhrnných údajů různých autorů bylo v souladu s etapami podle Dukesovy klasifikace pro antigen typické zvýšení jeho koncentrace: ve stadiu A - 7,8 ng / ml, B - 30,3 ng / ml, C - 58,1 ng / ml. ml, D - 134,3 ng / ml. Současně se zvýšila frekvence detekce CEA (při prahové hodnotě markeru 5 ng / ml) ve skupinách pacientů s indikovanými stádii a odpovídala 3, 25, 45 a 65% a při prahové hodnotě markeru> 2,5 ng / ml bylo zjištěno ještě častěji s výše uvedeným. Dukesovy stupně a odpovídaly 28, 45, 75 a 84%. Vzhledem ke skutečnosti, že ve stadiu A a B byl nádorový marker zvýšen pouze u 3-28% pacientů, jeho použití v časné diagnóze CRC je problematické. Vysoce diferencované tumory produkují CEA aktivněji.

Podle mnoha autorů má marker prognostickou hodnotu, která spočívá v tom, že vysoká počáteční hladina CEA v krevním séru (více než 25 ng / ml) indikuje vysoké riziko vzniku časného relapsu CRC po chirurgickém odstranění nádoru.

Jedním z příkladů použití CEA je stanovení radikální povahy chirurgického zákroku v CRC. Po radikálním chirurgickém odstranění nádoru se zpravidla do konce 6. týdne koncentrace antigenu dostane pod normální hodnotu. Pokud hladina markeru nespadne po odstranění primárního nádoru,

si myslí, že pacient má metastázy. Doporučuje se stanovit CEA u pacientů v pooperačním období po 3 měsících po dobu 2 let. Pravidelné sledování pacientů s CRC se zahrnutím CEA zlepšuje pětiletou míru přežití. Adjuvantní chemoterapie (5-fluorouracil a levamisol) u pacientů s CRC může způsobit přechodné zvýšení hladiny CEA v krevním séru. Při monitorování odpovědi na léčbu se nedoporučuje rutinně určovat CEA, nicméně u pacientů s CRC neexistují žádné alternativní testy k vyhodnocení odpovědi na léčbu.

U většiny pacientů s RTK (79,1%) byly ve srovnání s kontrolní skupinou (10%) detekovány protilátky IgM a IgG proti CEA, což také umožňuje použití tohoto indikátoru jako diagnostického markeru a nezávislého prognostického faktoru. Současně je detekce protilátek proti CEA v séru pacientů s CRC spojena s lepší prognózou a významným zvýšením 2leté míry přežití.

Analýza hladiny CEA ve výplachu tlustého střeva před endoskopickým rutinním vyšetřením ukázala, že tento jednoduchý test může být užitečný v praktickém lékařství k identifikaci skupin pacientů s vysokým rizikem CRC.

Použití CEA pro diagnostické účely je omezeno jeho nízkou specificitou v důsledku zvýšení koncentrace sérového antigenu v neneoplastických onemocněních, jakož i vlivu některých exogenních a endogenních faktorů na syntézu tohoto markeru. Při vyšetřování pacientů s nádory tlustého střeva se proto CA-19-9 používá jako marker druhé volby (viz níže). To je zvláště důležité v případě REA-negativních novotvarů.

Vzhledem k nízké citlivosti a specificitě se nedoporučuje používat definici CEA při screeningu CRC. V případě 5-násobného zvýšení CEA v séru a přítomnosti klinických stížností u pacienta je třeba navrhnout CRC.

Srovnávací analýza tří nádorových markerů (CA-19-9, CEA a α-fetoprotein) v séru pacientů s RTK v různých stadiích nádorového procesu u pacientů s chronickou ulcerózní kolitidou a u zdravých lidí ukázala významný rozdíl mezi pacienty s lokalizovaným RTK a chronickým nálezem. ulcerózní kolitidu z hlediska CA-19-9 a CEA, jakož i mezi lokalizovaným a generalizovaným RTK pro výše uvedené dva

nádorových markerů. Hodnoty nádorových markerů u chronické ulcerózní kolitidy nepřekročily hodnoty normálních hodnot. V lokalizovaném procesu hladina CA-19-9 nepřesahuje 1000 jednotek / ml, CEA - 20 ng / ml. Parametry a-fetoproteinu u CRC pacientů jsou v normálním rozmezí a zpravidla se zvyšují pouze v případě, že je nádorový proces zobecněn, což neumožňuje použití tohoto markeru v diagnostice onemocnění. Při použití komplexního CA-19-9 + REA je diagnostická senzitivita 91% a významně převyšuje senzitivitu při použití pouze jednoho nádorového markeru. Přístup k instrumentálním metodám diagnostiky dat o definici nádorových markerů (CA-19-9 a CEA) zvyšuje frekvenci detekce lokalizovaného CRC o 14% a při generalizaci procesu o 9%.

Pro nádory charakterizované nerovnováhou mezi procesy proliferace a apoptózy. Endothelin-1, polypeptid s 21 aminokyselinovými zbytky, má vazokonstrikční a mitogenní aktivitu a je také zapojen do mechanismů regulace apoptózy. Experiment ukázal, že endothelin-1 je faktorem přežití a je schopen in vitro chránit PTK buňky před apoptózou indukovanou FasL.

Frekvence detekce a hladina rozpustného antigenu Fas (sFas) - inhibitor apoptózy - v séru pacientů s RTK je vyšší než u prakticky zdravých lidí. U pacientů s RTK s metastázami v regionálních lymfatických uzlinách a játrech byla tendence ke zvýšení obsahu sFas v séru, což umožňuje diskutovat o roli systému Fas / FasL jako možného cíle pro protinádorovou terapii u pacientů s CRC.

Bylo prokázáno, že vysoká aktivita kaspázy-3 koreluje s vysokým rizikem relapsu RTK, zejména v případech jeho pravostranné lokalizace. Byla také zjištěna korelace aktivity kaspázy-3 s CD57 + buňkami filtrujícími nádor.

Důležitou roli v mechanismech regulace apoptózy v PTK hraje bcl-2, který je normálně exprimován buňkami, které lemují dno krypty tlustého střeva. Exprese bcl-2 v B-stupni RTK Dukes se ukázala být spojena s lepším přežitím pacientů, a proto u pacientů, u kterých nádory neexprimují bcl-2, se doporučuje provádět adjuvantní terapii.

Exprese imunoreaktivního p53 v primárním nádoru v CRC je marker vysokého rizika recidivy onemocnění po chirurgickém odstranění onemocnění a častěji po prvním roce pozorování. Současně byla zvýšená exprese p53 detekována u 47 a CEA u 34,4% nádorů. Předpokládá se, že při hodnocení prognózy CRC je nutné definovat oba markery.

Je známo, že genetické poškození rozlišuje primární karcinomy proximálního a distálního tračníku. Multivariační analýza exprese p53 v primárním CRC tak častěji odhaluje zvýšenou expresi p53 v distálním (58,5%) než proximálním (41,7%) RTK. Období bez relapsu je zároveň méně u nádorů p53 + (75 a 38%; p = 0,006). Vysoké riziko recidivy CRC bylo pozorováno u nádorů p53 + s jejich distální lokalizací. Posouzení exprese p53 v CRC může tedy sloužit jako marker pro včasný návrat onemocnění a je spojeno s lokalizací tumoru v orgánu.

Bylo prokázáno, že selhání chemoterapie u CRC je spojeno s multidrug rezistencí těchto nádorů. Ukázalo se, že exprese různých izoforem CD44 je spojena s agresivním chováním nádoru a vyvolává otázku, zda signál z tohoto receptoru moduluje citlivost nádoru na léčivo. Bylo také prokázáno, že CD44 indukuje aktivaci LYN a Akt src rodiny tyrosin kináz. Schopnost potlačit apoptózu může hrát klíčovou roli ve vývoji nádorů tlustého střeva, která je spojena s expresí CD44.

Aktivátory a inhibitory plazminogenu

Studium metaloproteináz extracelulární matrice, které jsou úzce spjaty s procesy invaze a metastáz nádorů, v posledních letech přilákalo pozornost výzkumníků. S rozvojem metastáz by měl být řetězec sekvenčních událostí vedoucích k uvolňování nádorových buněk z jejich původního prostředí a tvorbě nádorových uzlin ve vzdálených orgánech a tkáních. Předpokládá se, že pro zajištění procesů invaze a metastáz je zapotřebí komplexního proteolytického řetězce, včetně různých proteáz. Má se za to, že plazmin, který snižuje hladinu glykoproteinů extracelulární matrix a aktivuje některé prometalloproteázy, hraje klíčovou roli v procesech invaze a metastáz, zatímco

ve vícestupňovém proteázovém řetězci je serinová proteáza klíčovou polohou - aktivátor plasminogenu typu urokinázy (uPA), protože katalyzuje tvorbu plasminu z jeho prekurzorového plasminogenu. IRA receptor (Pc-uPA) také hraje důležitou roli, protože když se uPA váže na receptor, zvyšuje se jeho schopnost aktivovat plasminogen. Na druhé straně mohou být inhibitory uPA-PAI-1 a PAI-2 přítomny v PTK tkáních. Bylo prokázáno, že hladiny uPA a PAI-1 v CRC jsou vyšší než u homologní normální tkáně a benigních nádorů.

Otázka, zda uPA v lidské RTK pochází z nádorových buněk samotných nebo z elementů okolního stromatu (fibroblasty, makrofágy, leukocyty), zůstala po dlouhou dobu nezodpovězena. Nakonec Harvey a kol. bylo možné prokázat, že aktivátor pochází z rakovinných buněk samotných a není vypůjčen z prvků stromatu a antigen je nejintenzivněji detekován v apikálních a bazálních oblastech PTK buněk.

Nejreprezentativnější studie složek aktivačního systému plasminogenu ve vzorcích CRC byla provedena Fujii et al. Analyzovali také expresi genů uPA a PAI-1 pomocí metody PCR. Exprese UPA byla detekována u 58,8% nádorů. U pacientů s pozitivním uPA a negativními výsledky pro PAI-1 byla 5letá prognóza přežití významně horší. Multivariační analýza ukázala, že výsledky současného stanovení uPA a PAI-1 v CRC jsou nezávislé prognostické indikátory.

Přežití pacientů po chirurgickém zákroku nekoreluje s obsahem uPA ve stromatu nádoru, nicméně byl zaznamenán vzorec vztahující se k jeho hladině v epitelu nádoru, tj. Stanovení hladiny uPA může být testem pro diagnostiku RTK bez metastáz, stejně jako riziko časného relapsu. po operaci. Je možné, že proteázy mohou být cíleny léky, které zabraňují invazi a metastázám CRC.

Metastázy jater jsou důležitým faktorem omezujícím prognózu u pacientů s RTK. Existuje korelace mezi iRA a metastázami v játrech. Transdukce genu tPA do PTK buněk může být užitečná z hlediska boje proti jaterním metastázám.

Nejméně studovaným v klinickém smyslu je složka aktivačního systému plasminogenu považována za Rc-uPA, což je glykopeptid vázaný na membránu vázaný na membránu. Toto

receptor může také existovat v rozpustné formě (rRc-uPA) v extraktech z nádoru, stejně jako v krevní plazmě jak zdravých lidí, tak pacientů s rakovinou. Rozpustná Rc-uPA v plazmě je prakticky nezměněná molekula, avšak ani přesný mechanismus jejího uvolnění z buněčného povrchu, ani její biologická funkce není plně studován. Zvýšené hladiny rRs-uPA v plazmě byly detekovány u pacientů s RTK a koncentrace rRs-uPA je spojena s prognózou onemocnění. Je možné, že Pc-uPA může významně přispět ke zvýšení angiogeneze kolem nádoru, stejně jako k mikrovaskulárním metastázám.

Zvýšená exprese Rc-uPA, která charakterizuje invazivní schopnost nádoru in vitro alespoň v některých subpopulacích RTK buněk, je tedy částečně důsledkem konstantní aktivace signální kaskády závislé na mitogenem aktivovaných protein kinázách.

Receptory růstového faktoru

Jedním z důležitých regulačních systémů pro mitogenní signální transdukci je rodina receptorů tyrosinkinázy - produktů skupiny onkogenů c-erbB, která zahrnuje čtyři transmembránové receptory s podobnou strukturou receptoru epidermálního růstového faktoru (EPRF nebo ErbB1), stejně jako ErbB2 (HER2 / neu). ErbB3 (HER3) a ErbB4 (HER4). Kromě struktury se tyto receptory liší v relativní specificitě a afinitě pro různé běžné ligandy. Po aktivaci v důsledku vazby ligandu a dimerizace je aktivována vnitřní receptorová tyrosinkináza a získává schopnost fosforylovat jak receptor samotný, tak další buněčné proteiny podílející se na přenosu mitogenního signálu.

Na autokrinní a parakrinní regulaci proliferace buněk CRC se podílejí různé růstové faktory. V posledních letech byl klinický význam receptorů růstových faktorů a jejich ligandů aktivně studován v CRC, primárně RESR, receptoru růstového faktoru podobného inzulínu typu 1 (RIGR-1), receptoru vaskulárního endotelového růstového faktoru (R-VEGF).

REFR je onkogenní produkt c-erbB1, což je transmembránová tyrosinkináza, která je klinicky nejvíce studována v markerech této skupiny u nádorů s různou lokalizací, ale není dostatečně studována v CRC.

Receptory rodiny ErbB mohou tvořit jak homo-, tak heterodimery, a v mnoha případech jsou nejaktivnější heterostruktury s účastí druhého zástupce této rodiny, HER2 / neu, který nemá svůj vlastní ligand. HER2 / neu je tedy klíčovým prvkem v přenosu mitogenních signálů růstových faktorů podobných EGF a jeho blokování může významně zpomalit nebo zastavit růst nádorů, které jsou závislé na takových stimulech. Předpokládá se, že zvýšená exprese HER2 / neu v nádorech, včetně CRC, může sloužit jako marker citlivosti a cíl pro účinnější bioterapii těchto nádorů. Probíhají klinické studie a v literatuře jsou prezentovány předběžné studie o expresi HER2 / neu v prognóze nádorů gastrointestinálního traktu.

RIFR-1 a RIFR-2 jsou potenciální mitogeny a silné stimulátory růstu nádorových buněk. Účinky podporující růst obou typů FGID jsou zprostředkovány především FGED-1. Dosud neexistuje jediný názor na klinickou hodnotu RIFR-1 v CRC.

Většina studií ukázala inverzní vztah mezi objevem receptorů steroidních hormonů (endokrinní typ regulace) a EGFR (auto a parakrinní typ regulace) u nádorů.

Blokování kteréhokoliv ze stupňů přenosu mitogenních signálů růstových faktorů může v zásadě vést k dysregulaci proliferace nádorových buněk a potenciální inhibici růstu nádoru. Experiment již zkoumal dostatečně velký počet léčiv, které ovlivňují výše uvedené procesy: specifické a nespecifické blokátory vazby EGFR na ligandy, inhibitory tyrosinkinázy a další kinázy, blokátory vazby domén SH2 efektorových proteinů s aktivovaným receptorem, sloučeniny, které potlačují aktivaci genu ras; včetně inhibitorů farnesylace. Většina z nich je ve stadiu klinické studie, i když některé z nich, zejména Herceptin, již podstoupily klinické studie a ukázaly se, že jsou u některých typů nádorů poměrně účinné.

Je známo, že RTK jsou cílové tkáně steroidních hormonů a v 25 až 60% případů si zachovávají funkční schopnost primárního spojení mechanismu účinku jednoho nebo několika steroidů, jmenovitě estrogenových receptorů (RE; 40,9%), androgenů (RA; 15,5%). ), progesteron (RP; 32,6%) a glukokortikoidy (WG; 59,1%).

Jako kritérium pro příznivou prognózu 10letého přežití pacientů s CRC lze však použít pouze přítomnost ER a RP v nádoru. Současně jsou re-EGs častěji detekovány v RTK u žen (60,5%) než u mužů (39,5%), s lokalizovaným stadiem onemocnění (63,1%) a nádorem v pravých částech tlustého střeva (59,4%).

Nádorové markery angiogeneze

Výzkumníci v posledních letech projevili velký zájem o studium angiogenních faktorů v nádoru a zejména VEGF. Existuje stále více důkazů, že metastázy v různých stadiích nádorového procesu závisí na stupni vaskularizace nádoru.

Při hematogenních metastázách musí nádorové buňky přilnout k endotheliálním buňkám, projít do dutiny cévy, přežít v cirkulující krvi, zastavit se ve specifickém orgánu nebo tkáni a vytvořit tam kolonii. Vysoce angiogenní primární nádory, včetně CRC, s vysokou intratumorální vaskulární hustotou pravděpodobně produkují angiogenní klon ve vzdáleném orgánu, který je za příznivých podmínek schopen tvořit metastázy. Většina výzkumníků se domnívá, že vysoký stupeň nádorové vaskularizace je statisticky významným markerem přítomnosti metastáz v regionálních lymfatických uzlinách. V 77% předchozích studií byla zjištěna významná asociace mezi angiogenezí nádoru a rozvojem vzdálených metastáz. Ačkoli existují významné rozdíly ve studovaných skupinách pacientů a metodách používaných k hodnocení angiogeneze, většina výzkumníků prokázala inverzní vztah mezi vaskularizací nádoru a přežitím pacientů s CRC. Kromě toho nedostatečná vaskularizace a v důsledku toho její hypoxie zvyšují expresi genů spojených s rezistencí (Pg-glykoprotein, hydrofolát reduktázou) na chemoterapii a představují významnou neefektivnost neoadjuvantního záření a chemoterapie.

U většiny pacientů (73,4%) s regionálními metastázami v lymfatických uzlinách bylo období bez relapsu signifikantně vyšší v nepřítomnosti exprese VEGF a nízkého indexu SPF (S-fáze) v nádoru. Kromě prognostického významu VEGF bylo prokázáno, že blokování VEGF receptoru-2 inhibuje růst metastáz CRC v játrech.

V současné době má více než 200 sloučenin angiogenní aktivitu a všechny mohou být rozděleny do dvou skupin podle inhibičního účinku. První skupina zahrnuje sloučeniny, které ovlivňují přenos angiogenních signálů endotelovými buňkami (antagonisty endoteliálních růstových faktorů, inhibitory produkce angiogenních faktorů, migrace endotelových buněk) a druhé sloučeniny, které ovlivňují proliferaci endotelových buněk. Nejslibnější antiangiogenní léčiva jako marimastat, batimastat - inhibitory matrixových metaloproteináz, SU 6661.

Je třeba poznamenat, že v posledních letech významně vzrostly naše znalosti o biologických procesech, které se podílejí na tvorbě nových mikroskopických cév v nádoru. A přestože se stále vytvářejí prognostické a terapeutické principy, pokroky v chápání patofyziologických mechanismů neoangiogeneze u nádorů jsou již zavedeny do klinické praxe.

Hladina thymidylátsyntetázy v nádoru je považována za jeden z nejúčinnějších markerů rezistence na léčivo a prognózu CRC. Enzym je nezbytný pro syntézu DNA a katalyzuje methylaci monofosfátu deoxyuridinu na monofosfát deoxythymidinu jako kofaktoru 5,10-methylenetetrahydrofolátu (5,10-CH2FH4). Je známo, že 5-fluorouracil (5-FU), jeden z nejrozšířenějších antimetabolitů při léčbě gastrointestinálních nádorů, když je podáván pacientovi, tvoří formy 5-fluor-2'-deoxyuridin-5'-monofosfátu, které se kovalentně váží na timidylatsyntázu, čímž blokují Proces syntézy DNA v nádoru. Studie ukazatelů exprese thymidylátsyntetázy v nádorech pacientů s CRC umožnila považovat ji za nezávislý prognostický faktor v této kategorii pacientů. Současně bylo signifikantně nižší 10leté přežití u pacientů, u kterých byla detekována exprese tohoto enzymu.

Na základě retrospektivní multivariační analýzy a vysokého stupně spolehlivosti výsledků, podle definice, v expresi thymidylátsyntázy v nádorech může být tento marker použit na klinice jako nezávislý prediktivní faktor pro lokální recidivu, vzdálené metastázy, období bez relapsu a celkové přežití pacientů s RTK.

Nejlepší prognóza byla u pacientů s TRK s nízkou expresí thymidylátsyntetázy v primárním nádoru. Současně vědci přesvědčivě prokázali, že žádné jiné prognostické faktory, včetně věku, pohlaví, stupně diferenciace nádoru, exprese p53, nemohou být považovány za nezávislé markery prognózy, zejména opakování tohoto onemocnění.

Hladina exprese thymidylátsyntetázy v případě generalizovaného nebo rekurentního CRC může být markerem citlivosti tumoru na 5-FU. Nejčastěji byly nejvyšší hladiny exprese enzymu nalezeny v abdominálních metastázách CRC (82%) ve srovnání s metastázami nádoru v játrech (47%). Předpokládá se, že toto by mělo být vzato v úvahu při predikci citlivosti diseminovaných forem nádoru na 5-FU a individuálně měnící chemoterapeutickou strategii u pacientů.

Bylo také prokázáno, že exprese thymidylátsyntetázy a thymidinfosforylázy v nádorech neléčených pacientů s CRC má nejen prognostickou hodnotu při volbě 5-FU chemoterapie spolu s takovými markery proliferace, jako jsou p53 a Ki-67, ale také koreluje s ukazateli celkového přežití bez onemocnění a celkového přežití. Současně byla aktivita těchto dvou enzymů studována biochemickou metodou v čerstvě zmrazených vzorcích nádorů a jejich exprese byla porovnána pomocí imunohistochemické metody v parafinových řezech společně s p53 a Ki-67. Rovněž byla zjištěna významná korelace mezi indexem enzymatické aktivity thymidinfosforylázy a vazebnou aktivitou 5-fluor-2'-deoxysyridin-5'-monofosfátu (5-FU metabolitu). Bylo známo, že aktivita thymidylátsyntetázy a thymidinfosforylázy úzce souvisí s procesy angiogeneze a proliferace v CRC. Současně exprese VEGF významně korelovala s aktivitou thymidin fosforylázy a indexem Ki-67 v nádoru, stejně jako trvání období bez relapsu.

Při studiu dihydropyrimidindehydrogenázy, prvního enzymu, který metabolizuje 5-FU na 5-fluorodihydrouracil, bylo zjištěno, že index exprese tohoto enzymu v nádoru může být použit jako marker při stanovení citlivosti CRC na 5-FU.

Vysoká aktivita syntetázy oxidu dusnatého může sloužit jako marker agresivnějšího toku CRC.

Pro stanovení aktivity telomerázy v epitelu se navrhuje použít vysoce citlivou a specifickou metodu

CRC buňky cirkulující v krvi. Aktivita enzymu byla zjištěna u 72% nádorů ve stadiích C a D (klasifikace Dukes) CRC. Předpokládá se, že tento marker v této minimálně invazivní metodě může být použit v časné diagnóze, prognóze a monitorování pacientů s TCR.

Bylo zjištěno, že zvýšená exprese CDC25B fosfatázy v CRC buňkách ve 43% případů indikuje špatnou prognózu onemocnění. Tito pacienti proto potřebují adjuvantní terapii. Předpokládá se, že CDC25B může sloužit jako nezávislý prognostický marker a dokonce kontrolní faktory, jako jsou metastázy v regionálních lymfatických uzlinách, průměr primárního nádoru, stupeň jeho diferenciace a hloubka invaze. Navíc úroveň exprese CDC25B silně indikuje možný časný návrat CRC stupňů B a C podle Dukes.

Nedávno se objevily studie, které naznačují možnost použití enzymu pro syntézu prostaglandinů a eikosanoidů - cyklooxygenázy-2 (COX-2), také známé jako prostaglandinová endoperoxidová syntetáza - jako marker pro včasnou diagnózu a prognózu CRC. Experimentální a klinická data ukazují na významnou úlohu COX-2 v patogenezi CRC. Je ukázána nepřítomnost COX-2 v epitelu normální sliznice a exprese proteinu ve 40% polypů a 80-90% maligních nádorů tlustého střeva, což potvrzuje účast COX-2 v neoplastických procesech a v progresi CRC. Byla prokázána pozitivní korelace mezi expresí COX-2 a velikostí, stadiem nádoru podle klasifikace Dukes. Zvýšená exprese COX-2 v RTC se stala základem pokusů o použití jeho inhibitorů, zejména nesteroidních protizánětlivých léčiv, jako profylaktických činidel, která zabraňují rozvoji CRC a malignitě tlustého střeva. V pokusech na zvířatech bylo prokázáno, že inhibitory COX-2 mají ochranný účinek v kolorektální karcinogenezi. Tyto léky navíc zabraňovaly tvorbě nových polypů a přispívaly k regresi stávajících v tlustém střevě. Na druhé straně data z některých experimentálních studií naznačují, že protinádorový účinek nesteroidních protizánětlivých léčiv je také způsoben tím, že indukují apoptózu v PTK buňkách a inhibují angiogenezi v experimentálních nádorech.

Ostatní značky CRC

Stručně řečeno, zaměříme se na některé nádorové markery, jejichž použití je pro CRC slibné.

Hladina exprese MUC1 v nádorech může být použita jako marker při hodnocení progrese a prognózy CRC.

Cyklin-dependentní inhibitor kinázy P27 (KIP1) může být použit jako marker pro detekci časných stadií CRC. Nelze jej však použít jako marker pro časnou progresi těchto nádorů.

Nedávno bylo také navrženo použití nového markeru TA90-IC, který je přítomen v séru ve formě cirkulujících imunitních komplexů při odhadu prevalence RTK. Základem studie byla skutečnost, že podle mnoha autorů byla hladina CEA zvýšena pouze u 70% pacientů ve společném stádiu onemocnění. Vzdálené metastázy byly zjištěny u 86% vyšetřených pacientů, i když mnoho z těchto pacientů klinicky mělo lokalizovaný nádor bez známek zobecnění nádorového procesu. Analýza hladiny výše uvedených markerů ukázala, že koncentrace TA90-IC byla zvýšena u 82,9% a CEA pouze u 70,2% pacientů. Kombinace obou markerů nám umožnila stanovit prevalenci nádorového procesu v 93,5% případů. Vědci se domnívají, že tato práce musí pokračovat a prokázat úlohu TA90-IC při screeningu a sledování progrese CRC.

Je třeba poznamenat, že nejvhodnější z klinického hlediska může být současné stanovení pouze malého počtu doplňkových ukazatelů, které mohou charakterizovat proliferativní aktivitu CRC, jeho metastatický potenciál, citlivost na různé typy centrální a lokální regulace. Úkolem výzkumných pracovníků v této oblasti je zvolit optimální kvantitativně a kvalitativně kombinaci molekulárních markerů v diagnostice, monitorování a prognóze CRC.

4.4.3. CHOROBY RAKŮ Slinivky břišní, žaludku, jícnu a jater

V západní Evropě je rakovina slinivky břišní detekována přibližně v 10 případech na 100 000. Asi 90% všech nádorů.

onemocnění pankreatu jsou adenokarcinomy kanálků a pouze 5% jsou neuroendokrinní neoplazmy a acinarový karcinom.

Nejrozšířenějším markerem v diagnostice karcinomu pankreatu je CA 19-9. Specifičnost jeho stanovení se pohybuje od 76 do 99% a citlivost od 69 do 93%. Zvýšená koncentrace CA 19-9 v séru však není specifická pouze pro adenokarcinomy pankreatu. Vysoká hladina CA 19-9 byla zjištěna u jiných onemocnění gastrointestinálního traktu (akutní a chronická pankreatitida, cirhóza jater, zánět žlučových cest).

Bylo prokázáno, že pouze 55% pacientů s karcinomem pankreatu s průměrem nádoru menším než 3 cm má zvýšenou hladinu CA 19-9 (> 37 U / ml). V důsledku toho je použití markeru CA 19-9 v diagnóze rakoviny pankreatu, zejména jeho časných forem, omezené, protože jeho hladina stoupá i při výše uvedených benigních procesech v játrech a slinivce břišní. Doporučuje se stanovit ukazatele CA 19-9 pro odhad prognózy karcinomu pankreatu, nikoli však pro rutinní praxi.

V perspektivních studiích je také studováno mnoho dalších markerů pro rakovinu pankreatu: CA50, CA242, CA195, muciny DU-PAN 2, CAM 17.1 / WGA. V současné době by však CA 19-9 mělo být považováno za „zlatý standard“ v diagnostice karcinomu pankreatu.

Rakovina žaludku je jednou z nejčastějších forem nádoru na světě. V západní Evropě se její četnost v posledním desetiletí snížila, zatímco v Asii se úmrtnost zvýšila a je přibližně 100 na 100 tisíc. V USA zemře na rakovinu žaludku 6 pacientů na 100 tisíc.

Tři markery jsou studovány dostatečně podrobně pro karcinom žaludku: CEA, CA 19-9 a CA 72-4, ale CA 72-4 je považován za nejcitlivější a specifičtější. CEA a CA 19-9 mají stejnou specificitu, i když CA 19-9 může být citlivější než CEA, nicméně žádný z výše uvedených markerů nemůže být použit ve screeningu a včasné diagnóze karcinomu žaludku.

Výskyt rakoviny jícnu se značně liší. Ve střední Asii je tedy jejich výskyt 50-100 případů na 100 000, zatímco v Evropě a USA - 2-3 případy na 100 tisíc. V 90% karcinomu jícnu je zastoupen spinocelulární karcinom a méně než 10% adenokarcinom.

Ve srovnání s jinými gastrointestinálními nádory nebyly biochemické markery karcinomu jícnu dostatečně studovány. Předpokládá se však, že SCC a cytokeratiny (CYFRA 21-1, TPA, TPS) by měly být považovány za nejlepší markery v diagnóze rakoviny jícnu ze skvamózního epitelu, zatímco CA 19-9 je preferován v diagnostice adenokarcinomů jícnu. Nicméně nádorové markery v diagnóze nádorů jícnu dostaly jen malou pozornost vzhledem k jejich nespecifičnosti.

Další název tohoto onemocnění je „maligní hepatomus“. Taková diagnóza je prováděna v západní Evropě s frekvencí 5-10 případů na 100 tisíc av jižní Evropě méně než 5 případů na 100 tisíc. Rakovina jater je nejčastěji detekována v Číně, kde se doporučuje provést populační screening endemického zaměření tohoto tumoru za účelem zjištění nádorů..

Hlavním markerem v diagnostice hepatocelulárního karcinomu je α-fetoprotein, který při screeningu odhaluje nádory malé velikosti, což přispívá ke zvýšení pooperačního přežití v této kategorii pacientů. Je však třeba poznamenat, že úloha a-FP při screeningu hepatocelulárního adenokarcinomu nebyla stanovena prospektivními randomizovanými studiemi. Vzhledem k velmi vzácné detekci těchto nádorů v západní Evropě se má za to, že screening hepatocelulárního karcinomu není nutný. Nicméně, od roku 1986, jaterní ultrasonografie každých 6 měsíců a stanovení každé 3 měsíce koncentrace α-AF u pacientů pozitivních na povrchový antigen hepatitidy B, stejně jako těch, kteří trpí chronickou aktivní hepatitidou nebo jaterní cirhózou, byly doporučeny. Rovněž se má za to, že pacienti s perzistující infekcí, zejména pacienti s virovou hepatitidou C, by měli být rovněž považováni za ohroženi hepatocelulárním adenokarcinomem. Je prokázáno, že riziko vzniku tohoto nádoru u virové hepatitidy C a jaterní cirhózy je 100krát vyšší než u neinfikovaných lidí.

Jedním z důležitých problémů při použití a-FP v diferenciální diagnostice hepatocelulárního adenokarcinomu jsou hepatitida a jaterní cirhóza, při které se také zvyšuje hladina nádorového markeru. Separace fukosylovaného a-OP z normálního α-OP vazbou na lektiny proto pomáhá při diferenciální diagnostice výše uvedených onemocnění. Identifikace těchto frakcí α-OP pomáhá v diferenciální diagnostice hepatocelulárního karcinomu. Při benigních onemocněních se může hladina α-FP dočasně zvyšovat, zatímco u hepatocelulárního karcinomu se stále zvyšuje v krevním séru. Stanovení α-OP několikrát po dobu 2–3 týdnů proto umožňuje vyloučit jeho falešně pozitivní hodnoty. Kromě toho se nedávno objevil nový marker v diagnóze hepatocelulárního adenokarcinomu - des-gama-carboy prothrombin (DCP), také známý jako PIVKA II (protein indukovaný nedostatkem vitaminu K). Kombinace tohoto markeru s a-FP umožňuje identifikovat hepatocelulární karcinom v 86% a solitární nádor v 78,3%, a v těchto případech bude jeden z těchto markerů pozitivní.

4.4.4. NEFORMACE ŽENSKÉHO REPRODUKČNÍHO SYSTÉMU

Novotvary genitálií u žen představují 15% všech nádorů a jsou rozděleny podle rychlosti jejich rozpadu v následujícím pořadí: rakovina těla dělohy, vaječníků a děložního čípku. Ve struktuře úmrtnosti je však rakovina vaječníků první, následovaná rakovinou děložního čípku a dělohy. Například v USA je každoročně registrováno 20 tisíc nových případů rakoviny vaječníků a 12 tisíc úmrtí z tohoto nádoru. Etiologie onemocnění není známa, nicméně za rizikové faktory jsou považovány anovulace, použití některých antikoncepčních prostředků a také citlivost na rodinu.

Více než 90% nádorů vaječníků má epiteliální povahu, tj. vznikají z epitelu coelomic. Epiteliální ovariální tumory jsou klasifikovány na základě buněčného typu: serózní, mucinózní, endometrioidní, čiré buňky, smíšené epiteliální, nediferencované, skvamózní. Nejčastěji se rakovina vaječníků vyvíjí ze serózních buněk.

Nejlepším markerem epiteliálního ovariálního karcinomu je mucin - CA 125. Během menstruace může být hladina markeru u žen zvýšena na 100 kU / l a vyšší. Úroveň CA 125 stoupá u téměř 80% pacientů s epiteliálními ovariálními tumory, avšak pouze polovina pacientů s karcinomem vaječníků ve stadiu I podle mezinárodní klasifikace (FIGO) této choroby vykazuje vysoké míry nádorového markeru. Nedostatečná citlivost v časné diagnóze, stejně jako detekce zvýšených hodnot CA 125 u různých benigních nádorů a dalších adenokarcinomů neumožňují použití tohoto indikátoru jako markeru pro včasnou detekci rakoviny vaječníků. Spolu s hladinou jiných markerů (a-OP, hCG, hCGb) se může hladina CA 125 zvyšovat s nádory z buněk zárodečných buněk.

Prognóza rakoviny vaječníků závisí především na stadiu onemocnění. Screening CA 125 je necitlivý a pouze 50% pacientů ve stadiu I onemocnění má zvýšenou hladinu markeru, což je důvod, proč se tento marker nedoporučuje pro detekci sporadických případů onemocnění. Stanovení CA 125 v kombinaci s manuálním rektovaginálním vyšetřením pánevních orgánů a transvaginální ultrasonografie však může být důležité pro včasné zjištění rakoviny vaječníků.

Multicentrická prospektivní studie postmenopauzálních žen s nádory v malé pánvi a srovnání transvaginální ultrasonografie, manuálního vyšetření pánevních orgánů a stanovení CA 125 (prahová hodnota CA 125 35 kU / l) ukázaly, že tyto metody byly potvrzeny na 77, 76 a 74%.. Kromě toho bylo pomocí regresní analýzy prokázáno, že ve srovnání s ultrasonografií je CA 125 citlivější, ale diagnostická hodnota je nižší než u manuální studie. Nádory nejsou detekovány kombinací negativních výsledků těchto tří metod. Stanovení hladiny CA 125 před operací může vést lékaře k možnému množství chirurgických přínosů.

Je známo, že tradiční prognostické faktory u pacientů s rakovinou vaječníků jsou stadiem onemocnění, stupněm diferenciace a histologickým typem nádoru, velikostí zbytkového nádoru po paliativní cytoreduktivní operaci. Současně multicentrické studie ukázaly, že hladina CA 125 v séru pacientů po 1., 2. a 3. cyklu chemoterapie je jedním z nejdůležitějších prognostických faktorů časných ran.

relapsu onemocnění. Prodloužený poločas CA o 125 nebo méně než 7násobné snížení hladin nádorových markerů v prvních měsících po léčbě ukazuje na špatný výsledek. Další studie ukázaly, že koncentrace CA 125> 70 kU / l před třetím průběhem chemoterapie je nejdůležitějším faktorem při predikci progrese onemocnění v následujících 12 měsících.

CA 125 při monitorování pacientů s ovariálním karcinomem umožňuje detekovat časnou recidivu. V literatuře však nejsou žádná data naznačující, že včasná detekce recidivy onemocnění může zlepšit míru přežití. Zvýšení hodnoty CA 125 indikuje reziduální onemocnění v 94,8% případů, ale téměř polovina pacientů s normálním markerem měla také onemocnění (nádorové uzliny) podle „druhého vzhledu“ -parparomie. Hladiny CA 125 jsou zvýšeny v séru 25% pacientů, kteří mají pouze mikroskopické příznaky nemoci au 79% pacientů, jejichž průměr recidivujícího tumoru je více než 1 cm během laparotomie.

Rakovina prsu

Rakovina prsu (BC) je jednou z hlavních příčin úmrtí žen v západoevropských zemích a během života ženy je riziko tohoto nádoru 12,2% a riziko jeho úmrtí je 3,6%. Existuje mnoho faktorů, které jsou spojeny s rizikem rakoviny prsu: genetické a rodinné faktory, hormonální (časné menarche, pozdní menopauza, pozdní první těhotenství) faktory, dieta, benigní onemocnění prsu (hlavně spojené s atypickou hyperplazií).

V současné době je pro rakovinu prsu známa řada nádorových markerů: MIS-1 (CA 15-3), CEA, onkoproteiny, cytokeratiny. Nejrozšířenější jsou CEA a CA 15-3. Existují také další členové rodiny genů MIS-1: MSA, CA 519, BR27-29, BRMA. Všechny mají stejnou citlivost a specificitu, stejně jako SA 15-3. Použití několika značek proto okamžitě nepřidává k informacím získaným pomocí CA 15-3. V současné době se intenzivně zkoumá řada markerů, jako jsou cytokeratiny (TPA, TPS, CYFRA 21-1) a rozpustné onkoproteiny (c-erbB-2), které se podrobují klinickému hodnocení.

Citlivost nádorových markerů u pacientů s časným karcinomem prsu je velmi nízká (15-35%), takže jejich použití v diagnostice

často obtížné. Výsledné nízké hodnoty markerů samozřejmě nevylučují přítomnost primárních a metastatických ložisek. Na druhé straně vysoké hladiny markeru u pacientů s karcinomem prsu téměř zcela ukazují na přítomnost generalizace tumoru a jednotlivých metastáz.

Vysoké hladiny CEA, CA 15-3 a dalších markerů rodiny MIS-1 jsou jasně spojeny se stadiem karcinomu prsu, velikostí nádoru a zapojením regionálních lymfatických uzlin do nádorového procesu. Zatím však není jasné, zda jsou tyto markery nezávislé prognostické faktory. Navíc není známo, zda použití takového nádorového markeru jako indikátoru časné recidivy onemocnění povede ke zvýšení přežití bez relapsu a celkového přežití pacienta.

V případě radikální léčby karcinomu prsu lze v časné diagnóze relapsu prokázat sériové stanovení CEA a CA 15-3. Tyto nádorové markery během 2-18 měsíců (průměr 5,2 měsíce) se nacházejí u 40-60% pacientů s recidivujícím karcinomem prsu před pozitivní odpovědí podle výsledků klinických, instrumentálních a radiologických metod (rentgen hrudníku, ultrasonografie jater, skenování skeletu). Dynamické stanovení hladin CEA a CA 15-3 je považováno za poněkud citlivý test v časné diagnóze metastáz do kostí a jater a navíc snižuje frekvenci pacientů s izotopovými skenovacími a radioizotopovými diagnostickými postupy.

Tkáňové markery u karcinomu prsu

Na rozdíl od klasických nádorových markerů, určených v séru, jsou buněčné nebo tkáňové markery typizovány přímo v nádorové tkáni. Většina z nich charakterizuje určité biologické rysy nádoru, specifika jeho chování a regulace, například hormonální citlivost nebo tendenci k invazi a metastázám. U některých molekulárních markerů nebyla dosud stanovena specifická biologická funkce. Hlavní význam těchto markerů spočívá v tom, že charakterizují biologické vlastnosti každého specifického nádoru a pomáhají s predikcí a individualizací léčení onemocnění.

V záložce. 4.10 uvádí biologicky významné ukazatele, které jsou aktivními nebo potenciálními tkáňovými markery karcinomu prsu.

Tabulka 4.10. Hlavní skupiny tkáňových / buněčných prognostických markerů pro karcinom prsu

V obecném případě může mít definice molekulárního markeru u karcinomu prsu tři praktické výsledky: 1) identifikace mezi pacienty s raným stadiem rizikových skupin rakoviny vyžadujících další léčbu, stejně jako těch, kteří nepodléhají adjuvantní terapii; 2) stanovení citlivosti na určité typy terapie a individualizace schémat adjuvantní léčby pacientů s běžným procesem; 3) vývoj nových léků.

Receptory steroidních hormonů, především receptory estrogenů (ER), patřily mezi první indikátory zahrnuté v praxi léčby ukazatelů rakoviny prsu, které se týkaly kategorie buněčných markerů. O něco později byly kromě nich identifikovány receptory progesteronového receptoru (RP).

Přítomnost ER v primárním nádoru prsu ukazuje jeho potenciální citlivost na terapeutická opatření zaměřená na odstranění zdroje estrogenů z těla nebo na potlačení jejich účinků (ovariektomie, použití antiestrogenů).

RP je zajímavý jako molekulární marker karcinomu prsu, a to nejen proto, že je prvním prvkem buněčné odpovědi na progestiny, určujícím citlivost na odpovídající léčiva, ale také proto, že jeho syntéza v buňkách karcinomu prsu je indukována estrogeny. Přítomnost RP tedy může indikovat funkční aktivitu ER.

V současné době používají různé kliniky a laboratoře tři relativně ekvivalentní metody pro stanovení receptorového stavu karcinomu prsu: radioligand - stanovení vazebné schopnosti receptoru v cytosolu nádorů; enzymová imunoanalýza - stanovení koncentrace imunoreaktivního receptorového proteinu ve stejných cytosolech; imunohistochemicky specifické barvení nádorových řezů s použitím protilátek proti receptorovým proteinům. Výhoda prvních dvou metod je kvantitativní, což umožňuje objektivizovat kritéria pro hodnocení stavu receptoru. Radioligandová metoda také umožňuje vyhodnotit funkční aktivitu receptoru v jednom z prvních stupňů jeho interakce s hormonem, což činí spolehlivější predikci citlivosti hormonů než při stanovení imunoreaktivních proteinů.

Na druhou stranu, i když je imunohistochemická metoda v semikvantitativní povaze, má důležitý význam, a to, že při barvení řezů můžete jasně

pro stanovení příslušnosti receptorů k nádorovým buňkám. Při použití biochemických metod tato možnost chybí. Tato metoda navíc umožňuje pracovat s archivními materiály - parafínovými bloky a dokonce i hotovými brýlemi, což z něj činí jedinou možnou možnost, kdy se po výzkumu objevila nebo byla realizována potřeba výzkumu na receptorech steroidních hormonů.

Je známo, že hormonálně závislá varianta karcinomu prsu, když je typický jeden nebo alespoň jeden z receptorů steroidních hormonů, je charakterizována příznivým průběhem a pooperační období u těchto pacientů je lepší než u nádorů negativních na receptor. Nicméně v praktické klinické práci se výsledky stanovení receptorů steroidních hormonů používají hlavně při výběru pacientů citlivých na endokrinní terapii.

Receptory růstového faktoru. Tato skupina také zahrnuje samotné růstové faktory - proteiny a malé polypeptidy produkované samotnými nádorovými buňkami a další složky nádorové tkáně (fibroblasty, makrofágy a lymfocyty infiltrující nádor, endotelové buňky) a stimulující růst produkčních buněk (autokrinní mechanismus) nebo sousedních buněk (parakrin mechanismu).

Na autokrinní a parakrinní regulaci proliferace buněk karcinomu prsu se podílejí různé růstové faktory: peptidy skupiny EGF (a-transformující růstový faktor, amfiregulin atd.), Které interagují se společným receptorem, růstovými faktory podobnými inzulínu (IGF), somatostatinem atd. Receptory těchto růstových faktorů byly v nádorech u pacientů s rakovinou prsu. Přítomnost EGFR v nádoru mléčné žlázy, zejména v nepřítomnosti receptorů steroidních hormonů, ukazuje na nepříznivou prognózu onemocnění i v časných stádiích a rezistenci na endokrinní terapii. Existují důkazy, že přítomnost receptorů IGF a somatostatinových receptorů naznačuje příznivější prognózu karcinomu prsu.

Nicméně, vzhledem k nejednoznačnosti výsledků získaných různými autory, žádný z ukazatelů charakterizujících citlivost karcinomu prsu na auto a parakrinní regulátory dosud nevstoupil do rutinní klinické praxe, jako je studium hladiny receptorů steroidních hormonů. Lze však očekávat, že v blízké budoucnosti se opět zvýší zájem o studium EGFR u karcinomu prsu, a to z toho důvodu, že již ve stadiu klinického

studie, léky specificky působící na EGFR, monoklonální protilátky proti receptoru a inhibitory interní tyrosinkinázy EGFR, provádějící první fázi přenosu mitogenního signálu, byly uvolněny.

Je třeba poznamenat, že „zlatý standard“ ve studii rentgenové difrakce je považován za stanovení radioligandu v membránové frakci tkání s použitím EGF značeného 125 I a následné separace hydroxylového apatitu.

Určitého úspěchu v oblasti praktického použití markerů spojených s regulací růstu karcinomu prsu závislou na REFR bylo dosaženo již po objevení se léku Herceptin, což je humanizovaná protilátka proti HER2 / neu, jednomu z receptorů rodiny ErbB, do které patří REFR.

Rodina receptorů tyrosinkinázy - produkty skupiny onkogenů c-erbB, které zahrnují čtyři transmembránové receptory s podobnou strukturou, REFR (ErbB-1), ErbB-2 (HER2 / neu), ErbB-3 (HER3) a ErbB-4 (HER4) ) je jedním z nejdůležitějších regulačních systémů pro přenos mitogenních signálů.

Kromě struktury se ErbB rodina receptorů liší v relativní specificitě a afinitě pro různé běžné ligandy. Hlavním rysem všech receptorových tyrosin kináz je transmembránová lokalizace a potřeba interakce s odpovídajícím ligandem (aktivačním faktorem) pro realizaci kinázové aktivity a následných biologických účinků. Po aktivaci v důsledku vazby ligandu a dimerizace je aktivována vnitřní receptorová tyrosinkináza a získává schopnost fosforylovat jak receptor samotný, tak další buněčné proteiny podílející se na přenosu mitogenního signálu. Receptory rodiny ErbB mohou tvořit jak homo-, tak heterodimery a v mnoha případech jsou nejaktivnější heterostruktury s účastí receptoru HER2 / neu, který nemá svůj vlastní ligand.

HER2 / neu je tedy jedinečným reprezentantem uvažované rodiny transmembránových tyrosin kináz, protože bez vlastního ligandu a neinteragující s některým ze známých růstových faktorů, které aktivují příbuzné receptory, je nicméně klíčovým prvkem přenosu mitogenních signálů všech EGF- podobné peptidy a je nezbytné pro úspěšné fungování celého systému.

Pokud jde o prognostickou hodnotu nadměrné exprese nebo amplifikace genu c-erbB-2, navzdory gigantickému materiálu (více než 12 000 pacientů s rakovinou prsu bylo nyní vyšetřeno v různých laboratořích po celém světě), neexistuje žádná shoda na prediktivní hodnotě HER2 / neu. Někteří autoři zaznamenali jeho nepříznivý vliv na přežití pacientů s karcinomem prsu bez metastáz v lymfatických uzlinách bez recidivy, jiní výzkumníci nenalezli spolehlivý vztah mezi těmito ukazateli. Publikovaná data ukazují, že tumory s amplifikovaným genem HER2 / neu nereagují dobře na hormonální terapii, ale jsou citlivé na následnou chemoterapii. V současné době se také má za to, že pacientům s nádory pozitivními na HER2 / neu by měly být doporučeny intenzivnější režimy chemoterapie než pacienti s nádory, které nemají zvýšenou expresi tohoto onkogenu.

Systém aktivace plazminogenu. Schopnost metastazovat a invaze je jednou ze základních vlastností maligních nádorů, jejichž nejdůležitějším mechanismem je destrukce okolní bazální membrány a extracelulární matrice proteázami asociovanými s nádory. Tyto proteázy se také podílejí na neoangiogenezi, což přispívá k proliferaci nových krevních cév v nádoru.

Proteolytická kaskáda aktivace plasminu v nádorové tkáni zaujímá centrální místo. Má se za to, že plasmin, který je schopen snížit hladinu extracelulárních matricových glykoproteinů a aktivovat některé prometální proteázy, jako je například kolagenáza typu IV, hraje klíčovou roli jak v lokálním šíření nádoru, tak při tvorbě metastáz ve vzdálených orgánech a tkáních. Ve vícestupňovém řetězci proteáz, který vede k destrukci extracelulární matrice, zaujímá aktivátor urokinázového typu plasminogenu (uPA) klíčovou pozici. UPA receptor umístěný na povrchu buňky také hraje důležitou roli, protože schopnost uPA aktivovat plasminogen se zvyšuje, když se k němu váže. Obecně je proces tvorby plasminu cyklická amplifikace regulovaná mechanismem zpětné vazby.

Kromě aktivace uPA je aktivátor plasminogenu také aktivátorem tkáňového typu (tPA), ale jeho úloha ve vývoji nádorů se jeví jako opačná a snižuje destrukci nádorových buněk.

a ochranu okolních tkání. Aktivita IRA a tPA je inhibována dvěma inhibitory proteinu patřící do rodiny serpin, PAI-1 a PAI-2. Na základě experimentálních a klinických dat hrají během růstu nádoru dvě inhibitory aktivátorů plasminogenu také odlišnou roli: PAI-1 chrání nádorové buňky před autodegenerací a PAI-2 inhibuje proteolytické procesy v extracelulární matrici.

Různé složky aktivačního systému plasminogenu v prsní tkáni mohou být umístěny jak na samotných nádorových buňkách, tak na fibroblastech stromatu, lymfocytech a makrofágech a endotelových buňkách infiltrujících nádor. V tomto ohledu lze předpokládat, že aktivační proces plasminogenu je primárně parakrinní.

Úroveň a poměr exprese složek aktivačního systému plasminogenu v nádorové tkáni může sloužit jako indikátor metastatické a invazivní nádorové aktivity, v důsledku čehož je biologicky významný prognostický faktor pro zhoubné nádory nebo indikátor rizika malignity u benigních nádorů. Navíc potlačení aktivace plasminogenu urokinázovým typem na různých úrovních se může stát jedním z přístupů k vývoji nových typů antimetastatické terapie, pro které je klinické použití nezbytné pro identifikaci skupin pacientů potenciálně citlivých na tuto léčbu. Vývoj takových léků je již poměrně aktivně prováděn v experimentálních laboratořích a farmaceutických společnostech, což činí studium jejich cílových proteinů v lidských nádorech obzvláště důležité.

Nejvhodnější metodou stanovení úrovně exprese složek aktivačního systému plasminogenu je v současné době kvantitativní enzymová imunoanalýza pro stanovení jejich koncentrace v cytosolech tkání. Bohužel dosud nebyly stanoveny jednotné prahové hodnoty, ačkoli v tomto směru již probíhá mezinárodní výzkum v oblasti spolupráce.

Vaskulární endoteliální růstový faktor. V posledních letech byla věnována velká pozornost problematice neoangiogeneze - vzniku nových krevních cév - u zhoubných nádorů. Na rozdíl od vaskulogeneze je angiogeneze proces rozvětvení nových kapilárních procesů z existujících krevních cév. Skutečnost, že se nádor nemůže vyvíjet a růst bez tvorby

má rozsáhlou síť kapilár, které poskytují buňkám kyslík a živiny. Studium molekulárních mechanismů angiogeneze umožnilo přechod od mikroskopického hodnocení hustoty krevních cév v nádorové tkáni ke studiu specifických molekul podílejících se na regulaci tvorby a růstu nových krevních cév. Nejdůležitějším pozitivním regulátorem angiogeneze je nepochybně VEGF, nazývaný také faktor vaskulární permeability. Jedinečnost tohoto faktoru spočívá v tom, že na rozdíl od všech ostatních růstových faktorů je mitogenní pouze ve vztahu k endotelovým buňkám. Bylo prokázáno, že VEGF hraje klíčovou roli v neoangiogenezi karcinomu prsu.

Výsledky řady retrospektivních klinických studií publikovaných v nedávné době ukazují, že exprese VEGF u karcinomu prsu se jeví jako nezbytná pro prognózu onemocnění a také ovlivňuje citlivost nádorů na hormonální a léčbu drogami. Ero vysoká hladina indikuje špatnou prognózu jak pro rané, tak pro běžné karcinomy prsu. Kromě toho jsou aktivně vyvíjeny a zkoumány nové léky s antiangiogenními vlastnostmi a hodnocení aktivity angiogeneze závislé na VEGF může být základem pro jejich cílené použití.

Rakovina děložního čípku

Téměř po celém světě je rakovina děložního čípku po rakovině prsu druhou nejčastější příčinou úmrtí na nádorová onemocnění. Hlavními rizikovými faktory tohoto onemocnění jsou sociálně-ekonomické, brzké manželství, velký počet sexuálních partnerů a také infekce způsobené lidským papilomavirem (HPV) (typy 16, 18, 31 a 45). Ukazatele 5-letého přežití u tohoto onemocnění jsou asi 70%. Pokud je však novotvar detekován v raném stadiu, míra přežití 5 let se zvyšuje na 90%. Je třeba poznamenat, že 90% nádorů děložního čípku je karcinom skvamózních buněk, u jiných histologických typů je to adenokarcinom a spinocelulární karcinom. Sarkomy nebo neuroendokrinní karcinom jsou velmi vzácně nalezeny.

V diagnostice spinocelulárního karcinomu děložního hrdla se používá jako nádorový marker SCCA antigen - protein (molekulová hmotnost 48 kD) se silnou homologií rodiny inhibitorů proteáz, tzv. Serpinů. Citlivost metody ve stadiu I onemocnění je menší než 30% a ve stadiu IV - 90%. Nicméně

Exprese SCCA může také vzrůst u jiných spinocelulárních nádorů (rakovina plic, nádorů hlavy a krku, rakovina jícnu a vagíny), benigní nádory kůže (lupénka, ekzémy), plíce (sarkoidóza), játra a ledviny. Tento nádorový marker se nepoužívá při screeningu.

Pro screening rakoviny děložního čípku byly po celém světě navrženy Papanicolauovy programy, instrumentální a morfologické diagnostické metody, které diagnostikují preinvazivní nádory, jako je karcinom in situ (CIS) a intraepiteliální neoplázie děložního hrdla (CIN). Vývoj těchto procesů v průběhu 10-15 let může předcházet rakovině děložního hrdla. V diagnostice časných stadií se SCCA nepoužívá, protože hladina nádorového markeru závisí na objemu primárního nádoru, stadiu a postižení lymfatických uzlin v nádorovém procesu. Zvýšené hladiny SSCA před léčbou mohou být nezávislým faktorem při hodnocení metastatického poškození regionálních lymfatických uzlin.

Vysoké hodnoty markeru před léčbou indikují špatnou prognózu u pacientů se spinocelulárním karcinomem děložního čípku. Některé studie ukázaly, že SCCA může být používán jako nezávislý prognostický faktor u karcinomu děložního hrdla. V adenokarcinomech děložního hrdla je CA 125 užitečnější jako prognostický faktor, ale ne SCCA.

Marker SCCA je určen pro detekci časné recidivy karcinomu spinocelulárních buněk děložního čípku, stejně jako monitorování před neoadjuvantní terapií a před recidivující terapií nádoru. V těchto případech je korelace 80%, což má významný klinický význam při výběru pacientů pro následnou radioterapii nebo chirurgickou léčbu.

Rakovina endometria představuje 50% všech zhoubných nádorů urogenitálního traktu u žen a v 80% případů se vyskytuje při vyšetření dělohy. Přežití ve stadiu I je 80%, při IV - 10%. V 60-80% případů mají nádory strukturu adenokarcinomu.

Nejčastěji rakovina endometria zvyšuje nádorový marker CA 125: ve stadiu onemocnění až na 22% a ve stadiu III-IV - až na 80% je hladina markeru vyšší než 35 kU / l. Neexistuje žádný nádorový marker pro screening pro včasnou detekci karcinomu endometria. Morfologický výzkum je považován za tradiční metodu.

diagnostika karcinomu endometria a tkáňové vzorky získané po kyretáži sliznice dělohy.

Při sledování karcinomu endometria se za nejlepší marker považuje CA 125. U 60% pacientů s časnou recidivou nádoru bylo zjištěno, že zvýšení séra bylo CA 125.

4.4.5. LUNG CANCER

V ekonomicky rozvinutých zemích je mužská populace zhoubných novotvarů plicního karcinomu ve struktuře celkové mortality 21%. Rakovina plic je prototyp nádoru indukovaného chemickými karcinogeny. Byl nalezen úzký vztah mezi rozvojem rakoviny plic a kouřením cigaret, ale ne všichni kuřáci mají rakovinu, ale pouze 5–10%, což naznačuje významnou úlohu genetické predispozice u těchto pacientů. V téměř 50% případů může být chirurgická léčba doporučena během počáteční diagnózy, ale pouze u 70% z nich je nádor resekovatelný.

Hlavními histologickými typy rakoviny plic jsou: spinocelulární (PRL), adenokarcinom, karcinom velkých buněk a karcinom plic (MRL). Je třeba poznamenat, že MRL se liší od jiných histologických typů nádorů plic znaky svého klinického průběhu. Proto jsou všechny maligní plicní tumory rozděleny na SCLC a nemalobuněčný karcinom plic (NSCLC), které jsou součástí heterogenní skupiny nádorů.

U karcinomu plic jsou nejčastěji studovány následující markery: neuron-specifická enolasa (HCE), CEA, 19 cytokeratinový fragment (CYFRA 21-1), spinocelulární antigen (SCC), CA 125, tkáňový polypeptidový antigen (TPA).

Enoláza specifická pro neurony byla poprvé nalezena v mozkových neuronech a v periferním nervovém systému. HSE je isoenzym enzymové enolasy cytoplazmatického glykolytického enzymu (2-fosfo-D-glycerát hydroláza, EC 4.2.1.11) a skládá se ze dvou téměř identických polypeptidových řetězců typu y, jejichž molekulová hmotnost je rovna 39 000 D. V mozku spolu s isoformou - dimer z podjednotek typu a a hybridní izoenzym a y, které mají podobnou afinitu k substrátu - 2-fosfoglycerové kyselině. Enoláza obsahující tuto podjednotku y (a-y a y-y) se nazývala HCE. Izoformy mohou být syntetizovány gliovými mozkovými buňkami, stejně jako většinou somatických buněk.

tkáně. Samotný enzym je syntetizován v centrálních a periferních neuronech a maligních nádorech neuroektodermálního původu (SCR, neuroblastomy, střevní karcinoidy).

Ukázalo se, že horní hranice HSE u zdravých lidí je 12,5 ng / ml. Vzhledem k tomu, že koncentrace do 20 ng / ml

a více se může vyskytnout u benigních plicních onemocnění, pro klinickou diagnostiku je výhodná vyšší úroveň prahové hodnoty markeru (> 25 ng / ml). Zvýšení aktivity HCE v séru bylo zjištěno u 40-70% primárního

pacientů s IRL au 83–98% pacientů se společným stadiem onemocnění.

Podle údajů poskytnutých Memorial Sloan Kettering Cancer Center (USA), frekvence zvýšení aktivity HCE v séru pacientů s SCR závisí na prevalenci nádorového procesu: ve stadiu I-II je citlivost testu 39%, ve stadiu III-IV - 87%. Je třeba poznamenat, že v analýze diagnostického významu mnoho autorů identifikuje relativně vysokou specificitu ve srovnání s jinými markery. Aktivita emfyzému tak vzrostla pouze ve výjimečných případech, na rozdíl od toho byla koncentrace CEA zvýšena u 7-36% pozorování. Výsledky výzkumu naznačují, že HCE je docela použitelný jako vybraný nádorový marker, a to jak v diferenciální diagnostice, tak v monitorování účinnosti léčby MRL.

Současně bylo zjištěno zvýšení aktivity HCE v séru pacientů s tuberkulózou (27,3%), stejně jako u pacientů infikovaných virem HIV ve srovnání s neinfikovanými. Pacienti s alveolárními infiltráty nebo intersticiálními ložisky v plicích také významně zvýšili hladiny HCE v séru. Předpokládá se, že zvýšení sérové HSE u pacientů s benigními plicními chorobami je spojeno s lokální hypoxií. Prezentované výsledky by měly být vzaty v úvahu při analýze HCE u pacientů s karcinomem plic a při obstrukčních plicních procesech.

Je třeba poznamenat, že vzhledem k významné heterogenitě karcinomu plic, zejména varianty malých buněk, je možné zaznamenat významný diagnostický a prognostický význam HCE ve srovnání s jinými nádorovými markery.

Do skupiny patří také rakovinový embryonální antigen, reprezentovaný glykoproteinem s molekulovou hmotností přibližně 180 kD

onkofetální antigeny, syntetizované a vylučované střevními buňkami embrya a plodu, jakož i některé maligní nádory (prsa, žaludek, rakovina plic). Poprvé byla CEA zjištěna u pacientů s rakovinou tlustého střeva. V současné době byly sloučeniny podobné CEA detekovány také na buněčných membránách v ne-embryonálních a nerakovinných tkáních. Tam je každý důvod věřit, že játra jsou hlavní metabolické místo CEA. Hladina CEA v krevním séru je zvýšena u 40-80% pacientů se zhoubnými nádory endodermálního původu, u 20-30% u jiných forem rakoviny au 10-20% u benigních nádorů. Nejvyšší citlivost CEA a nejvyšší koncentrace markeru byly zjištěny u adenokarcinomu a karcinomu plicních buněk.

Sérový spinocelulární karcinom je protein s molekulovou hmotností 48 kDa, který je podobný serpinům (inhibitory proteáz). Marker se používá v diagnostice spinocelulárního karcinomu v různých orgánech (rakovina děložního čípku, jícnu, plic, nádorů hlavy a krku). Více než 70% pacientů s PRL má zvýšené hladiny. Pouze v 26,1% hladiny nádorového markeru se v séru zvyšuje adenokarcinom plic a není detekován SCR. U 87,8% pacientů s časným relapsem PRL byla zaznamenána vysoká hladina sérového SCC. Identifikace exprese SCC v imunohistochemické studii plicních nádorů má velký praktický význam.

Tkáňový polypeptidový antigen je polydisperzní směs cytokeratinů 8, 18 a 19 (molekulová hmotnost od 20 do 45 kD), která může polymerovat v roztoku za vzniku oligomerů. Aktivita TPA závisí na aminokyselinové sekvenci a poloze zbytku argininu. Obvykle se nachází ve vysokých koncentracích v placentě a fetálních tkáních. TPA je lokalizován na plazmatické membráně a endoplazmatickém retikulu nádorových buněk, je produkován proliferujícími buňkami a spontánně uvolňován do prostředí. TPA se nachází téměř ve všech zhoubných nádorech.

Fragment cytokeratinu 19. Význam cytokeratinu pro diferenciaci fyziologické a patologické tkáně je již dlouho znám v histopatologii. Cytokeratiny jsou nerozpustné buněčné proteiny, více než 20 z nich je nyní dobře charakterizováno monoklonálními protilátkami. V kontrastu

z celé molekuly jsou fragmenty cytokeratinu rozpustné v séru. Při testu nádorového markeru CYFRA 21-1 se používají dva typy monoklonálních protilátek (Ks 19.1 a BM 19.21) k detekci fragmentu cytokeratinu 19 s molekulovou hmotností 30 kD. Horní hranice normálu u zdravých lidí je 2,3 ng / ml. Test CYFRA 21-1 má dobrou specificitu pro benigní onemocnění plic, prahová hodnota je 3,3 ng / ml. Marker má vysokou citlivost v diagnostice NSCLC.

Žádná asociace CYFRA 21-1 s kouřením. Bylo prokázáno, že hladina CYFRA 21-1 je stejná v séru pacientů s maligními plicními chorobami, SCLC a v kontrolní skupině. Současně byly u pacientů s NSCLC, adenokarcinomem a PRL pozorovány významně vyšší hladiny CYFRA 21-1. Prezentovaná data potvrdila vysokou citlivost a specificitu CYFRA 21-1 v diferenciální diagnóze mezi maligními a maligními plicními chorobami, stejně jako mezi MRL a NSCLC. Pacienti s metastázami v lymfatických uzlinách N2 a N3 mají nejvyšší hladiny CYFRA 21-1 v séru (5,6 ng / ml) (limity fluktuace 3,2-11,5 ng / ml) ve srovnání s pacienty s N0 a N1. (3,9-10 ng / ml) (Mann-Whitneyho U-test; p = 0,0373).

U všech typů rakoviny plic má CYFRA 21-1 nejvyšší citlivost (57,7%) ve srovnání s CEA (45,3%) a SCC (22,6%). Ačkoli kombinace CYFRA 21-1 a CEA pro diagnózu NSCLC, citlivost a přesnost jsou zvýšeny na 75,4 a 78,1%, ale specificita klesá na 86,5%.

Japonští výzkumníci (University of Tsukuba) navrhli, aby se kromě stanovení cytologického vyšetření s cílem zlepšit diagnózu a diferenciální diagnostiku rakoviny plic použili stanovení hladiny CYFRA 21-1 v pleurální tekutině. To je dáno tím, že u pacientů s karcinomem plic (průměrně 84,5 ng / ml) byl v pleurální tekutině u pacientů s karcinomem plic zjištěn významný nárůst markeru (průměrně 84,5 ng / ml) ve srovnání s pacienty s benigními nádory (13,9 ng / ml). Navíc je hladina CYFRA 21-1 v pleurální tekutině pacientů s PRL významně odlišná od hladiny pneumonie, zatímco CEA takové rozdíly neodhaluje.

Při určování CYFRA 21-1 je třeba si uvědomit možné zvýšení hladiny až na 10 ng / ml v případě progresivních benigních onemocnění jater a zejména v případě selhání ledvin. Kontaminace vzorku slinnými prvky může také

k významnému zvýšení hodnoty CYFRA 21-1. V tomto případě výsledek nemá vliv na pohlaví, věk, kouření a těhotenství. Studie všech typů solidních nádorů ukázaly, že CYFRA 21-1 je účinným markerem pro NSCLC a PRL.

V závěru se podívejme na některé rysy použití markerů maligního růstu na klinice rakoviny plic na klinice.

Nejprve byste neměli používat všechny výše uvedené markery při screeningu na asymptomatickou rakovinu plic nebo u pacientů s vysokým rizikem vzniku tohoto typu nádoru. Primární diagnóza a primární léčba pacientů s karcinomem plic jsou založeny na klinických a instrumentálních metodách vyšetření (klinické, endoskopické, rentgenové, intraoperační nálezy).

Dále by měl být marker NSE považován za velmi důležitý v imunohistochemické diagnostice nádorové varianty. Často jen stanovení HCE v séru pomáhá potvrdit diagnózu SCLC.

Koncentrace SCC v séru> 2 mg / l ukazuje 95% pravděpodobnost detekce NSCLC a 80% karcinomu dlaždicových buněk.

Při hladinách CA 125 by měla být navržena hladina nad 100 U / ml a CEA nad 10 mg / l, adenokarcinom nebo rakovina plic velkých buněk.

Konečně, i když často koncentrace v séru CYFRA 21-1, TPA, HCE, CEA ukazuje přítomnost nádoru, není pozorován

silný vztah mezi produkcí nádorových markerů a histologickou variantou plicního tumoru. Ve většině případů vysoká úroveň v tomto případě indikuje prevalenci nádorového procesu, a proto by prognóza měla být zklamáním. Nízké a průměrné hodnoty těchto markerů však nikdy neumožňují zcela eliminovat jakoukoliv variantu nádoru nebo progresi onemocnění.

I přes všechna výše uvedená omezení mohou být nádorové markery v primární diagnóze rakoviny plic důležité v následujících situacích.

Za prvé, antigeny asociované s nádorem exprimované během počáteční diagnózy by měly být použity pro monitorování u daného pacienta. CYFRA 21-1, REA a CA 125 jsou vysoce významné prognostické faktory v NSCLC a HCE v MRL.

Za druhé, snížení hladiny nádorových markerů v pooperačním období (

2-3 dny pro CEA, 1 den pro NSE, několik hodin

pro CYFRA 21-1) poskytuje lékaři užitečné informace o radikální povaze provedené operace a účinnosti léčby, a tedy o dobré prognóze. Na druhé straně pomalý pokles hladiny markeru v krevním séru indikuje nededičnost provedené operace a naznačuje přítomnost reziduálních nádorových ložisek.

Za třetí, postupné zvyšování nádorového markeru může být prvním příznakem relapsu onemocnění. Takové zvýšení lze zjistit 12 měsíců před klinickými příznaky relapsu. Pro rakovinu plic může HCE sloužit jako kritérium pro diferenciální diagnostiku různých histologických typů nádorů, zejména v případech, kdy není možné provést biopsii a potvrdit typ nádoru s morfologickými daty.

4.5. MOLECULÁRNÍ GENETICKÁ DIAGNOSTIKA

Hlavním úkolem moderní molekulárně genetické diagnostiky (MHD, DNA diagnostika) je detekce dědičných anomálií pro následné použití v diagnostice, vypracování prognózy a volba léčebné strategie pro mnoho onemocnění. Současně je MHD považován za mnohem širší než prostá analýza sekvence lidské genomové DNA, protože téměř vždy další informace o dědičném onemocnění lze také získat analýzou stavu samotných chromosomů a RNA a proteinů a metabolitů.

Stejně jako ostatní metody klinické biochemie se genetické testování používá pro diferenciální diagnostiku onemocnění. U řady onemocnění, například u dědičných forem rakoviny nebo „metabolických chyb“, se detekce mutací stává diagnostickým kritériem tak důležitým jako klinické symptomy. Hlavní výhodou diagnostiky DNA je ovšem schopnost určit náchylnost k určitému onemocnění v presymptomatickém stadiu. V některých případech to umožňuje zabránit rozvoji samotného onemocnění chirurgickým zákrokem, lékovou terapií nebo změnou životního stylu pacienta. Kromě toho, prenatální testování DNA může detekovat dědičnost patologických genů, a proto určit indikace pro umělé přerušení těhotenství.

Je nutné poznamenat takový slibný směr MHD jako farmakogenetika. Přesná typizace genotypu pacienta umožňuje hodnocení genů přímo souvisejících s absorpcí, metabolismem a působením léčiva, tj. Existuje reálná příležitost identifikovat pacienty, kteří jsou zvláště citliví na konkrétní léčivo, a vyhnout se komplikacím způsobeným intolerancí tohoto léčiva během léčby. V některých případech genotypování také umožňuje vybrat nejvhodnější lék. Již se dá říci, že s rozvojem farmakogenetiky se léčba léky bude stále více spoléhat na analýzu genotypu pacienta.

Využití MHD v klinické praxi tak nabízí dostatek příležitostí nejen pro diagnostiku a hodnocení genetického rizika onemocnění, ale také pro výběr individuální léčby léky. Předpokládá se, že aktivní vývoj lidské molekulární genetiky dá diagnostiku DNA na stejnou úroveň jako takové nepostradatelné nástroje v arzenálu biochemického lékaře, jako jsou například metody pro stanovení aktivity enzymů v krvi.

4.5.1. TYPY GENETICKÉHO REBUILINGU

V populaci je obvykle několik variant (alel) každého genu. Pokud je četnost těchto variant poměrně vysoká a nelze ji vysvětlit náhodným výskytem identických mutací v různých rodinách, pak hovoříme o polymorfismu daného lokusu.

Vzácnější varianty genů jsou označovány jako mutace. Jaká je hranice mezi polymorfismem a mutacemi? Předpokládá se, že polymorfismus zahrnuje varianty genů, které se nacházejí v heterozygotní formě, a mutace nižší než v 1% populace. V praxi se však mutanty často nazývají alely, které předurčují určitou patologii, i když je jejich frekvence v populaci vyšší než 1%. Níže jsou uvedeny typy mutací, které mohou vést k patologickým změnám.

Nejčastějším typem mutace jsou mutace nebo substituce nukleotidů. Substituce nukleotidů v některých pozicích kodonů nevede k nahrazení kódované aminokyseliny; takové mutace se nazývají tiché nebo synonymní. Když se kódované aminokyseliny mění v důsledku mutace missense, funkce proteinu se často mění. Zachování funkce proteinu je pozorováno, pokud

aminokyselina odvozená od mutantního kodonu patří do stejné strukturní třídy jako normální aminokyselina. Jednorukleotidové substituce mají největší účinek na protein, což vede k tvorbě stop kodonu (nonsense mutací). Zkrácená mRNA a protein jsou často neaktivní a rychle degradují.

• Odstranění a vložení. Tyto mutace se liší délkou od jednoho do milionu nukleotidů, a proto se nazývají mikro- a makro-delece (inserce). Makromutace pochopitelně ovlivňují velmi velké chromozomové segmenty (od 10 milionů párů bází), tj. je možné je detekovat pomocí cytogenetické analýzy. Mikromutace ovlivňují malé množství nukleotidů a pro jejich nalezení se používají metody analýzy nukleotidové sekvence DNA. Malé inzerce a delece nemusí ovlivňovat funkci kódovaného proteinu. Fatální následky jsou obvykle pozorovány, když počet inzerčních / delečních nukleotidů není násobkem tří. Když k tomu dojde, posun čtecího rámce a bezvýznamná aminokyselinová sekvence je syntetizována. Nejčastěji je velmi rychle přerušena tvorbou nového stop kodonu. Klasickým příkladem účinku posunu rámce na účinky delece jsou dvě související nemoci - Duchenne a Beckerova svalová dystrofie. Oba jsou způsobeny mutacemi v genu pro dystrofin a 2/3 těchto mutací jsou v obou delečních onemocněních. Beckerova svalová dystrofie je mnohem mírnější než Duchenne, ale tento rozdíl nesouvisí s velikostí delecí. Důvodem rozdílů je to, že ve většině detekovaných případů Duchenneovy myodystrofie vedou delece k posunu ve čtecím rámci a v důsledku toho se dystrofin přestává tvořit úplně, zatímco u Beckerovy myodystrofie si mutantní dystrofin zachovává určitou aktivitu.

V některých případech mutace ovlivňují nekódující oblasti DNA, které se účastní iniciace transkripce daného genu nebo sestřihu mRNA. Tyto změny mohou také vést k narušení struktury, stability nebo normální regulaci exprese tohoto proteinu.

• Nestabilní nebo dynamické mutace se obvykle vyvíjejí v oblastech obsahujících více kopií trinukleotidových repetic. V důsledku chyb replikace DNA nebo nerovnoměrného křížení se počet takových opakování může zvýšit nebo snížit, v důsledku čehož se tyto mutace nazývají dynamické. Pokud je číslo

opakování překročí určitou prahovou hodnotu, funkce daného nebo blízkých genů je narušena. Mechanismy vypnutí genů během akumulace trinukleotidových repetic nejsou zcela jasné. Zejména u syndromu křehkého chromozomu X vede zvýšení počtu CGG opakování v lokusu FRAXA nad 200 k methylaci a inaktivaci tohoto genu. Zvýšení počtu opakování trinukleotidů je také základem Huntingtonovy choroby (více než 35 CAG opakování v Huntingtonově genu) a myotonické dystrofie (více než 50 opakování v 3'-netranslatované oblasti DMPK genu kódujícího protein kinázu). Charakteristickým rysem těchto onemocnění je, že v jedné rodině se závažnost onemocnění může v řadě generací zvýšit v důsledku expanze nukleotidových repetic.

Obecně, výskyt mutací vede ke změně funkce nebo exprese proteinu. Tato změna se projevuje jako zvýšení a snížení, často až do úplné ztráty, funkce nebo exprese proteinu. V případě funkčního zvýšení je také možné, aby protein získal nové funkce.

POHYB S FUNKCÍMI ZTRÁTY

Snížení funkční aktivity proteinu ve tkáni může být výsledkem změny jak struktury proteinu, tak transkripční aktivity daného genu. Například snížení hladiny exprese LDL receptoru v důsledku mutace v promotorové oblasti povede k přesně stejné hypercholesterolemii, která by byla pozorována, kdyby byly syntetizovány normální množství funkčně defektního receptoru, který by nemohl vázat nebo internalizovat lipoproteiny.

Změny ve struktuře proteinů způsobené aminokyselinovými substitucemi nebo narušením zpracování mRNA v důsledku mutací v místech sestřihu vedou k výskytu abnormální mRNA a proteinů, které podléhají zrychlené degradaci, což vede ke snížení celkového množství aktivního proteinu. Například tři nejčastější defektní alely genu thiopurin methyl transferázy kódují rychle degradující proteiny, což má za následek prudký pokles aktivity enzymu, který je doprovázen zvýšenou citlivostí pacientů na thiopuriny. V jiných případech, jako je a-talasémie, může být pozorována delece celého genu, což vede k úplné absenci produktu.

Mechanismy ztráty skutečné funkční aktivity proteinu mohou být velmi rozdílné. V důsledku toho mohou mutace

nahrazení aminokyselin, které hrají klíčovou roli ve struktuře nebo katalytické aktivitě. V důsledku mutací může být narušeno normální zpracování nebo transport proteinu. Například nejčastější mutace způsobující cystickou fibrózu, delece fenylalaninu v poloze 506 genu CFTR, neovlivňuje syntézu nebo funkční aktivitu tohoto proteinu, naruší však jeho intracelulární transport, v důsledku čehož není začleněna do plazmatické membrány a ztrácí tak svou schopnost fungovat. jako chlorový kanál.

Mutace se ztrátou funkce zpravidla vedou k onemocněním s recesivním způsobem dědičnosti. To je způsobeno skutečností, že pro plné fungování metabolické dráhy je obvykle dostatek množství aktivního proteinu, který je produkován jednou normální alelou. A většina z těchto nemocí.

Méně časté jsou případy, kdy množství syntetizovaného proteinu je nedostatečné. V tomto případě se onemocnění začne objevovat, i když je jedna mutantní alela a dědičnost se stává dominantní. O těchto onemocněních je známo jen málo, jednou z nich je familiární hypercholesterolemie způsobená defektem genu LDL receptoru. Toto onemocnění je také charakterizováno účinkem genové dávky, která se projevuje tím, že familiární hypercholesterolemie je u homozygotů ve srovnání s heterozygoti mnohem závažnější.

Dominantní typ dědičnosti se projevuje, když mutantní protein nejen ztrácí svou aktivitu, ale také interferuje s fungováním normálního alelového produktu v heterozygotech. Tato situace byla zahrnuta v literatuře nazvané dominantně negativní efekt. Tento účinek se nachází v případě multimerních proteinů, které zahrnují zejména kolageny nebo dimerní transkripční faktory.

MUTACE S FUNKCÍM NABÍJENÍ

Ze široké škály funkcí pro zvýšení mutace jsou nejzajímavější z hlediska klinické biochemie případy, kdy protein získává novou funkci. Nově získaná funkce se může vyskytovat na úrovních, jako je interakce enzymu s novým substrátem, nevratná aktivace proteinu přenášejícího signál nebo iontový kanál, narušení normálního procesu inaktivace enzymu, abnormální oligomerizace proteinu nebo syntéza chimérického proteinu.

Chybná mutace Al₃₆₆-Šedá v genu GNAS1 kódující a-podjednotku heterotrimerního GTP-vazebného proteinu Gs. Tento protein spojuje receptory 7-doménových transmembránových hormonů s adenylát cyklázou. Mutace vede ke dvojité změně vlastností proteinu. Za prvé, uvolnění GDP je urychleno, a proto se zvyšuje podíl GTP-vázaného (aktivního) proteinu ασ, což vede ke konstitutivní aktivaci adenylátcyklázy. Za druhé se protein stává termolabilní při 37 ° C. V tomto ohledu se ve všech orgánech, s výjimkou varlat, snižuje aktivita Gs, což vede k rozvoji dědičné osteodystrofie Albright. A ve varle, kde je teplota nižší, je protein Gs nevratně aktivován, což vede k testoxikóze.

Nejčastějším důvodem pro získání funkce je zvýšená exprese genu nebo porušení místa nebo času jeho exprese, které je nejvíce charakteristické pro maligně transformované buňky.

Pro mutace s pořízením funkce je zpravidla charakteristický dominantní typ dědičnosti. V těch vzácných případech, kdy jsou mutace s nástupem funkce v homozygotním stavu, jsou pozorovány velmi závažné formy onemocnění, často s prenatální mortalitou. Příkladem je homozygotní achondroplasie, nejběžnější příčina trpaslíků, která je způsobena mutacemi v genu FGFR3, který kóduje receptor pro růstový faktor fibroblastů. Delece místa chromozomu, na kterém se FGFR3 nachází v jiných onemocněních, nevedou ke kosterním abnormalitám charakteristickým pro achondroplasii, což naznačuje zvýšení nebo získání funkce v tomto onemocnění. Achondroplasie se vždy nachází v heterozygotní formě, protože homozygozita pro tuto vlastnost je smrtelná.

ZÁSADY HLEDÁNÍ MUTACÍ

Obecný přístup k hledání mutací v lidské genomové DNA je založen na řadě principů.

Použití jedné nebo druhé metody v diagnostice DNA závisí na dostupnosti informací o možném typu mutace u daného pacienta. V případech, kdy typ mutace není znám, jsou pro detekci jakýchkoli rozdílů v nukleotidové sekvenci mutantních a normálních genů použity screeningové metody. Pokud je mutace známa, například byla již identifikována u příbuzných, pro vyšetření se používají jiné, jednodušší.

a zároveň účinnější metody, které lze nazvat metodami detekce známých mutací.

Dále, bez ohledu na směrnost (screening nebo detekce) zvolené metody, je nutné vzít v úvahu, že jedna skupina metod je založena na specificitě párování nukleotidů při tvorbě dvojitého řetězce DNA a druhá na rozpoznání sekvence DNA enzymy.

Pro první skupinu metod jsou jako referenční sekvence použity fragmenty sekvence sledovaného genu, odpovídající divokému typu, tj. Nejběžnější v populaci. To může být buď krátký oligonukleotidový primer (asi 20 nukleotidů), nebo delší DNA fragment použitý pro hybridizaci. V případě, že DNA pacienta obsahuje mutaci v oblasti pokryté vzorkem, není možná úplná hybridizace mezi mutantní alelou a vzorkem. To vede buď k nepřítomnosti produktu polymerázové řetězové reakce (PCR) nebo k vytvoření nedostatečného duplexu DNA obsahujícího nepárové nukleotidové oblasti, které jsou detekovány různými chemickými nebo enzymatickými metodami.

Klasickým příkladem metody založené na rozpoznávání sekvencí DNA enzymy je použití restrikčních enzymů, enzymů, které štěpí DNA v oblastech obsahujících striktně jednotlivé sekvence o délce 4-8 nukleotidů. Výskyt odchylek v nukleotidové sekvenci v důsledku mutace může vést buď ke ztrátě již existujícího místa štěpení jakéhokoliv restrikčního enzymu, nebo naopak k jeho vzhledu. Ve stejné skupině metod se používají enzymy DNA polymerázy. Tyto enzymy syntetizují komplementární řetězec v přesném souladu se sekvencí jednořetězcové matrice. Pomocí značených nukleotidových bloků je možné určit, v které sekvenci jsou nukleotidy umístěny v dané matrici. Tento princip je základem enzymatického sekvenování (stanovení nukleotidové sekvence) podle metody Sangera, stejně jako v jeho zjednodušených verzích, určených pro stanovení nukleotidové sekvence krátkých úseků DNA (mini-sekvenování).

V převážné většině případů, před analýzou vlastních mutací, je studovaný fragment genomu pacienta amplifikován pomocí PCR. Cílem PCR je obvykle jednoduché násobení.

počet kopií tohoto fragmentu, který umožňuje technicky následnou analýzu DNA (obr. 4.3). Ve většině variant PCR v heterozygotech jsou jak normální, tak mutantní alely amplifikovány se stejnou účinností a jejich diskriminace je prováděna v následujících stupních. Existuje také alelická specifika

Obr. 4.3. Schéma polymerázové řetězové reakce

PCR, ve které jsou použity primery, které jsou homologní k normální nebo mutantní alele, což umožňuje, aby byla přítomnost mutace stanovena již ve fázi PCR přítomností nebo nepřítomností amplifikačního produktu.

Další univerzální metodou běžně používanou pro diagnostiku mutací je sekvenování DNA. Sekvenování se používá jak pro vyhledávání neznámých mutací, tak pro potvrzení porušení zjištěných jinými metodami. Stávající metody umožňují sekvenování produktů PCR přímo, obchází klonování fragmentu PCR v bakteriích. Výhodou sekvenování je všestrannost a vysoce informativní. Hlavním omezením této metody je vysoká cena, která neumožňuje její použití jako hlavní při vyhledávání mutací.

Počet existujících metod analýzy mutací je extrémně velký a jejich popis bez nadsázky bude vyžadovat samostatnou knihu. Níže jsou popsány pouze ty metody, které jsou lépe přizpůsobeny pro použití v klinické praxi, tj. splňují následující požadavky: dostatečná citlivost k identifikaci mutací, dobrá reprodukovatelnost, nízké náklady a možnost automatizace.

METODY MUTAČNÍHO SCREENINGU

Metody screeningu mutací se používají v případech, kdy charakter mutace není znám, a klinický obraz dědičného onemocnění naznačuje, ve kterých konkrétních genech by mohlo dojít k přeskupení. Například přítomnost typu hypercholesterolemie IIa v kombinaci s xantomy šlach naznačuje přítomnost familiární hypercholesterolemie a naznačuje, že mutace by měla být vyhledávána v genech spojených se záchytem LDL buněk, primárně v genu LDL receptoru. Protože mutace v tomto genu s familiární hypercholesterolemií jsou velmi rozdílné a mohou ovlivnit celou délku genu, je nutné analyzovat velké části DNA. Sekvenování takového dlouhého genového fragmentu je příliš drahé, proto se používají jednodušší metody.

ANALÝZA MAKRO-RESTORING DNA BLOTTING

Hledání makroskopické DNA pomocí Southern blotování. V této metodě je genomová DNA zpočátku fragmentována za použití restrikčního enzymu, načež následuje vznik výsledné

DNA fragmenty se separují gelovou elektroforézou, denaturují a přenesou na nitrocelulózovou membránu. DNA na tisku získaném z gelu (blot) se inkubuje se značeným fragmentem studovaného genu, který hybridizuje s těmi fragmenty genomové DNA, které tento gen obsahují. V přítomnosti makroskopické DNA, která ovlivňuje tento gen, se soubor nebo velikost fragmentů, se kterými značený vzorek hybridizuje, bude lišit od normy.

Obr. 4.4. Heteroduplexní analýza

HETERODUPLEXNÍ ANALÝZA Hledání mikrodelecí / inzercí s velikostí menší než 25 párů bází a substitucí jednotlivých nukleotidů je obtížnější. Pro jejich analýzu se často používají speciální varianty elektroforetických metod. Jedním z nejjednodušších je heteroduplexní analýza (Obr. 4.4). V tomto způsobu se vzorek obsahující směs normálního (referenčního) a amplifikovaného fragmentu DNA, který je předmětem zkoumání, zahřívá, aby se DNA denaturovala, a pak se ochladí s obnovením struktury dvouvláknové DNA. Protože přítomnost malých rozdílů v nukleotidové sekvenci nebrání hybridizaci, část výsledných duplexů se skládá z referenční a testované DNA. V referenčních a testovaných oblastech DNA, lišících se nukleotidovým složením, je normální párování nukleotidů nemožné a vzniká takzvaný nesoulad. Dvojvláknová DNA, která má nesoulad ve své struktuře, na elektroforéze migruje odlišně než plně komplementární duplex, což umožňuje detekci abnormálně migrujících fragmentů po barvení DNA.

ANALÝZA POLYMORFISMU ZHODY SINGLE-GRANN DNA

Další populární elektroforetickou metodou mutačního screeningu je konformační polymorfismus jednovláknového konformačního polymorfismu (SSCP). Princip metody je založen na skutečnosti, že pokud je denaturovaná zahříváním DNA prudce ochlazena, nebudou tvořeny převážně dvojvláknové duplexy, ale krátké dvouvláknové oblasti uvnitř každého jednovláknového DNA fragmentu (Obr. 4.5). Obvykle se vytvoří několik relativně stabilních variant, které v důsledku rozdílné prostorové konformace migrují na elektroforéze různými způsoby. Oblasti intrachainové komplementarity jsou obvykle krátké a jakákoliv změna v důsledku dokonce i substituce s jedním nukleotidem obvykle vede k vymizení této formy intrachainového duplexu. V důsledku toho se na elektroforegramu mění distribuce a intenzita jednovláknových pásů DNA. Tato metoda neříká nic o povaze rozdílů v nukleotidové sekvenci, takže abnormální vzorky musí být sekvenovány.

Obr. 4.5. Analýza polymorfismu konformace jednovláknové DNA

ELEKTROFORÉZA DNA ARCHITEKTURY Β DENATURANT GRADIENT Více elektricky reprodukovatelný a informativní než SSCP je elektroforetická analýza DNA v denaturačním gradientu (obr. 4.6). Je zřejmé, že jakákoliv substituce nukleotidů povede ke změně síly duplexu DNA a bude denaturovat do jednotlivých řetězců při abnormální teplotě nebo koncentraci denaturačního činidla ve srovnání s normální sekvencí. V této metodě se elektroforéza provádí v polyakrylamidových gelech obsahujících vyšší koncentraci denaturantu ve spodní části než v horní části. Během elektroforézy jsou normální a mutantní DNA fragmenty denaturovány v různých částech gelu. Jelikož mobilita výsledných jednotlivých řetězců je mnohem nižší,

Obr. 4.6. Elektroforéza v denaturačním gradientu

než dvouvláknová DNA (díky konformačním charakteristikám jednovláknové DNA), denaturovaný fragment prudce zpomaluje migraci, zatímco dvojvláknový pokračuje v pohybu. Result V důsledku toho migrují normální a mutantní fragmenty DNA v různých vzdálenostech v gelu. Někdy jako denaturant nepoužívejte chemickou látku, ale teplotní gradient.

DENATURING FUEL-EFFICIENT LIQUID

CHROMATOGRAFIE Rozdíly v síle normálních a mutantních duplexů mohou být také detekovány pomocí denaturační vysokoúčinné kapalinové chromatografie. V tomto způsobu je fragment DNA, podobně jako elektroforetické metody popsané výše, vystaven gradientu denaturačních činidel, ale analýza DNA se provádí chromatografickou metodou za použití spektrofotometrické detekce. Tato metoda je velmi citlivá a snadno se automatizuje, a proto se stále více používá pro klinickou diagnostiku DNA.

CHEMICKÁ DETEKCE NEBALOVANÉHO NUKLEOTIDU Druhá skupina metod je založena na detekci mutací pomocí enzymů nebo chemického zpracování, které specificky ničí oblasti nekomplementárního párování.

Analyzovaný DNA fragment je denaturován, smíchán s kontrolním vzorkem obsahujícím normální DNA a ochlazen za vzniku duplexů, z nichž některé, pokud má pacient mutace, budou obsahovat oblasti nepárovaných bází. Ošetření DNA heteroduplexu hydroxylaminem nebo oxidem osmičelým vede k modifikaci nepárových nukleotidů obsahujících cytosin a thymidin. Následné zpracování piperidinem vede ke štěpení DNA na nukleotidu. Výsledkem je, že velikost DNA je zachována v normálních vzorcích a ty mutantní obsahují sadu fragmentů odpovídající mutacím ovlivňujícím nukleotidy C nebo T. Tato metoda není široce používána, pravděpodobně v důsledku vysoké toxicity použitých činidel.

OCHRANA PROTI RÁMŮ V jiném způsobu je přítomnost nepárových nukleotidů stanovena pomocí enzymu RNázy. Tato metoda využívá značené RNA sondy odpovídající normální genové sekvenci, která hybridizuje se studovaným DNA fragmentem (Obr. 4.7). Jako součást duplexu DNA / RNA je RNA rezistentní na RNázu, proto se tato metoda nazývá ochrana proti RNase. Avšak v oblastech odlišných v nukleotidové sekvenci mezi vzorkem a analyzovaným vzorkem nenastává párování nukleotidů. Tvorba fragmentů RNA se zaznamenává elektroforézou. Tato metoda je jednou z nejcitlivějších a screeningově specifických mutací, ale nebyla široce používána, zjevně kvůli nepohodlí při práci s labilními RNA sondami. Existují další metody založené na rozpoznávání enzymů nepárových bází; není jasné, jak široce se budou používat v klinické diagnóze.

SNÍMÁNÍ DIAGNOSTICKÝCH MUTACÍ Elektroforetické metody mutačního screeningu jsou nenulovou citlivostí, obvykle detekují pouze přibližně polovinu mutací a polymorfismů v analyzovaných fragmentech a pouze citlivost denaturace.

elektroforéza se blíží 100%. V kombinaci s relativně nízkou cenou a možností automatizace je tato metoda stále populárnější.

Dalším rysem screeningových metod je, že s pozitivními výsledky je nutná další sekvenční analýza nebo analýza restrikčních enzymů, protože screeningové metody nejsou

Obr. 4.7. Metoda ochrany RNázy

poskytnout jakékoli informace o povaze nukleotidových rozdílů. Při provádění diagnostiky DNA nestačí detekovat odchylku v nukleotidové sekvenci u pacienta, což vede k nahrazení kódované aminokyseliny. Je nutné potvrdit, že tato aminokyselinová substituce je funkčně významná. Přímý způsob spočívá v získání rekombinantního mutantního proteinu a stanovení jeho aktivity. Tento časově náročný a nákladný přístup se používá hlavně pro výzkumné účely. V praxi se častěji zaměřují na typ substituce aminokyselin. V případě, že normální a mutantní aminokyseliny patří do různých strukturních tříd, je pravděpodobnost funkčních změn v proteinu vyšší. Pravděpodobnost dysfunkce proteinu je ještě vyšší, pokud mutace ovlivňuje evolučně konzervované části genu, tj. Ustanovení, ve kterých je stejná aminokyselina přítomna v několika druzích savců. Přítomnost těchto míst obvykle ovlivňuje syntézu, transport nebo fungování proteinu a jakákoliv změna v nich ovlivňuje aktivitu proteinu. Například sekvenční analýza genu LDL receptoru čínského křečka, králíka, potkana, myši a Xenopus laevis demonstrovala 81, 79, 77, 76 a 70% homologii s lidským receptorem. Databáze UMD-LDLR přístupná přes internet obsahuje řadu programů pro analýzu mutací v genu pro LDL receptor, včetně možnosti analyzovat konzervatismus každého genového segmentu.

Další informace o patogenitě mutace lze získat vyšetřením příbuzných pacienta. V případě, že stejná mutace je přítomna u příbuzných pacientů se známkami tohoto onemocnění (například zvýšená hladina cholesterolu u familiární hypercholesterolemie), ale u zdravých jedinců chybí (více než 100 dárců je obvykle vyšetřováno bez známek tohoto onemocnění), pravděpodobnost, že Tato mutace je patogenní, velmi vysoká.

Obecně platí, že navzdory neadekvátní citlivosti metod screeningu mutací je poměr mezi obsahem informací a náklady na tyto metody poměrně vysoký a v praxi se široce používají. Je však třeba mít na paměti, že jejich negativní prediktivní síla je malá. Jinými slovy, nepřítomnost jakýchkoli znaků vzorku DNA při analýze skríninkovými metodami neznamená, že tato DNA neobsahuje mutace.

METODY DETEKCE MUTACE

V případě, že jsou známy možné varianty genetického přeskupení a není jich mnoho, můžete použít metody, které jsou rychlejší a levnější než metody mutačního screeningu. Tyto metody jsou založeny buď na DNA hybridizaci, nebo na schopnosti restrikčních enzymů rozpoznat dobře definované nukleotidové sekvence nebo DNA polymerázy pro syntézu DNA, která je komplementární k matrici (mini-sekvenování).

Obr. 4.8. Restrikční analýza

ANALÝZA OMEZENÍ Nejjednodušší metodou detekce mutací je restrikční analýza (Obr. 4.8). Základem této metody je velmi vysoká specificita restrikčních endonukleáz s ohledem na určité nukleotidové sekvence. Každý z těchto bakteriálních enzymů rozpoznává striktně individuální sekvenci 4-8 nukleotidů a štěpí dvojité vlákno DNA uvnitř nebo v blízkosti tohoto místa. Stačí nahradit jeden nukleotid, aby došlo k porušení tohoto enzymu. V těch případech, kdy je polymorfní nukleotid součástí restrikčního místa, může být genotypován se 100% spolehlivostí pomocí restrikčního enzymu. Nukleotidové substituce nejčastěji porušují stávající restrikční místa, ale někdy vytvářejí nová místa. Nevýhodou tohoto způsobu je, že polymorfní nukleotidy nejsou vždy v rozpoznávacích místech jakékoliv restrikční sekvence. Částečné řešení je možné v případech, kdy oblast, ve které je mutace lokalizována, obsahuje alespoň některé nukleotidy, které tvoří restrikční místo. Kompletní restrikční místo může být vytvořeno uměle během PCR. K tomu se používají primery, které plně neodpovídají sekvenci nukleotidů v oblasti mutace, ale obsahují 1-2 nekomplementární nukleotidy, které doplňují restrikční místo, které bude zahrnovat polymorfní nukleotid. Obvykle zavedení malého počtu nekomplementárních bází mírně snižuje účinnost PCR, takže po amplifikaci se v produktu objevuje nové restrikční místo, ve kterém je také zahrnut polymorfní nukleotid. Další restrikční analýza se provádí stejným způsobem jako ve standardní metodě.

ALLELSPECIFIC PCR V některých případech může být PCR použita k obohacení studovaného fragmentu genomové DNA, ale k přímé detekci mutace (Obr. 4.9). V tomto provedení jeden z primerů hybridizuje s oblastí DNA, ve které je umístěn polymorfní nukleotid. Teplota nasedání primerů je vybrána tak, že vazba primeru a následná amplifikace probíhají pouze s úplnou shodou sekvencí DNA a primeru. Když se například primer odpovídající mutantní sekvenci váže na normální DNA, vytvoří se nepárový nukleotid, který sníží sílu vazby primeru na DNA. Při dostatečně vysokém teplotním základu žíhání

Obr. 4.9. Alelicky specifická polymerázová řetězová reakce

obecně se přestává vázat na normální alelu, PCR nepokračuje a produkt se neakumuluje. Obvykle se paralelně provádí reakce s primerem odpovídajícím normální alele. Tato reakce slouží jako pozitivní kontrola, která ukazuje normální průběh amplifikace. Vzhledem k tomu, že přítomnost jednoho chybného párování může mírně snížit sílu vazby primeru na DNA, někdy je do sekvence primeru zavedena druhá neshoda, aby se duplex dále destabilizoval a snížil se výtěžek produktu v přítomnosti nepárového nukleotidu v polymorfní oblasti.

PCR AL REAL REMAINS

Výhoda výše popsané alelicky specifické metody PCR je snížení počtu stupňů v analytickém postupu, protože nevyžaduje zpracování produktu restrikčními nebo použití komplexních elektroforetických metod.

Ještě více je metoda urychlena pomocí PCR v reálném čase (RT-PCR). V této metodě není tvorba produktu monitorována elektroforézou, jako je tomu u standardní metody PCR, ale přímo během PCR pro akumulaci dvouvláknové DNA v reakčním médiu. Akumulace DNA se stanoví po každém polymeračním cyklu zvýšením fluorescence barviva SYBR Green nebo jeho analogů, jejichž fluorescence dramaticky vzroste při interakci s dvouvláknovou DNA, ale nezávisí na přítomnosti nukleotidů nebo primerů. Přístroje pro RT-PCR jsou kombinací PCR zesilovače a fluorimetru. Po dokončení amplifikace může být specifičnost získaného produktu stanovena měřením teploty tání, která je sledována za účelem snížení fluorescence SYBR Green.

TESTOVÁNÍ TAQMAN Existují i jiné způsoby registrace produktu PCR přímo v reakční směsi bez elektroforézy. Metoda, patentovaná Hofmannem LaRochem, je založena na detekci amplifikované DNA za použití oligonukleotidové sondy, která hybridizuje se střední částí amplifikované sekvence. Na koncích oligonukleotidových vzorků, nazývaných TaqMan, jsou nukleotidy značeny dvěma různými fluorescenčními barvivy, z nichž jedno zhasne fluorescenci druhého. V důsledku zhášení je hladina fluorescence druhého barviva malá. Taq polymeráza, která doplňuje nový řetězec z jednoho z primerů, rozděluje vzorek TaqMan, který se váže na střed amplifikované oblasti DNA v důsledku své exonukleázové aktivity, což vede k tomu, že fluorescenčně značené nukleotidy jsou uvolňovány do roztoku a zhášecí účinek zmizí, protože je pozorován pouze u případy, kdy jsou fluorofory umístěny blízko sebe. Výsledkem je, že fluorescence barviva zvyšuje čím dál více, tím více oligonukleotidových vzorků bylo zničeno DNA polymerázou během amplifikace, tj. čím více produktu vzniklo. Tato metoda se také používá k analýze mutací. K tomu se použijí dva vzorky TaqMan, značené různými páry fluoroforů a lišící se nukleotidovou sekvencí v polymorfní oblasti, z nichž jedna odpovídá divokému typu a druhá mutantnímu. Degradace vzorku DNA polymerázy

Obr. 4.10. Sondy TaqMan. P - reportérové barvivo, fluorescence T - quencher

se provádí při teplotě, při které se skladují pouze plně komplementární komplexy mezi analyzovaným fragmentem a vzorky. Zvýšením fluorescence barviv, které tvoří normální nebo mutantní vzorek, je možné určit, které varianty jsou v analyzovaném vzorku přítomny. Tato metoda vám umožňuje spolehlivě rozlišit mezi hetero-a homozygotními nosiči mutací.

MOLECULÁRNÍ BAKENY Metoda molekulárních majáků je implementována další metodou detekce mutací na základě vlivu zhášení fluorescence (Obr. 4.11). Oligonukleotid se nazývá bóje, jehož 3'- a 5'-konce jsou značeny dvěma barvivy, z nichž jedno působí jako inhibitor. Na rozdíl od TaqMan vzorků, bóje jsou delší a obsahují blízko konců krátkých doplňkových částí každého jiný, který při běžné teplotě navzájem žíhaly tvořit vlásenkovou strukturu. V tomto případě se barviva umístěná na koncích oligonukleotidu vzájemně přibližují a fluorescence jednoho barviva se zastaví jiným barvivem. Uprostřed bóje nukleotidová sekvence odpovídá studované oblasti DNA. Po denaturaci zahřátím, které vede k roztavení vlásenkové části, je směs DNA s bóje ochlazena, což umožňuje vytvořit duplex bóje s analyzovanou DNA. Po dalším ochlazení se kolíky znovu vytvoří ve volných bójkách a fluorescence se sníží. Naopak v majácích navázaných na analyzovanou DNA,

Obr. 4.11. Metoda molekulárních majáků. P - reportérové barvivo, fluorescence T - quencher

barviva zůstávají od sebe vzdálená a jejich fluorescence zůstává vysoká. Hybridizace testované DNA s kbelíky obsahujícími normální nebo mutantní nukleotidovou sekvenci v centrální části umožňuje stanovení genotypu testované DNA.

HYBRIDIZACE S VŠECHNY SPECIFICKÝMI

Tento způsob je založen na hybridizaci testované DNA s oligonukleotidy homologními s místem mutace a okolní sekvencí. Tato metoda existuje ve dvou formách. Někdy je produkt PCR imobilizován na pevné bázi a značené oligonukleotidy jsou přidány v roztoku. Podmínky promývání jsou zvoleny tak, aby byly zničeny duplexy obsahující nepárové báze. V důsledku toho zůstávají na matrici pouze oligonukleotidy, které jsou 100% komplementární k analyzované DNA. Přidáním oligonukleotidů odpovídajících sekvenci k normální nebo mutantní variantě je možné určit, který nukleotid je přítomen v analyzované DNA. Ve druhé variantě této metody jsou oligonukleotidy imobilizovány na matrici, se kterou značený produkt PCR hybridizuje.

Výhodou metody hybridizace s oligonukleotidy je možnost její miniaturizace, kdy je na mikročipu imobilizován široký soubor oligonukleotidů, což umožňuje současně detekovat mnoho mutací. Hlavním problémem této metody je potřeba přísného výběru podmínek pro hybridizaci a promývání neúplně komplementární DNA. Není jasné, jak široce bude tato metoda použita v praktické diagnostice DNA.

ALL-SPECIFIC LIGASE REACTION Efektivní metodou pro detekci jedno-nukleotidových substitucí a krátkých přeskupení je ligázová reakce (Obr. 4.12). Analyzovaná DNA hybridizuje se dvěma oligonukleotidy, z nichž jeden končí nukleotidem, který je komplementární k polymorfnímu místu, a druhý přímo k němu přiléhá. Po skončení hybridizace enzym DNA ligáza spojuje oligonukleotidy tak, aby vytvořily delší fragment, který se značně liší od původních oligonukleotidů v mobilitě.

Obr. 4.12. Alelicky specifická ligázová reakce

s elektroforézou. Pokud oligonukleotidy nejsou plně komplementární k fragmentu DNA a po hybridizaci, je v polymorfní oblasti vytvořen nepárový nukleotid, ligáza nezesíří takové oligonukleotidy a netvoří se dlouhý fragment. Prováděním ligázové reakce s jedním společným a jedním ze dvou vzorků specifických pro alelu lze tedy genotypovat vzorek DNA pro daný nukleotid.

V této metodě je produkt PCR hybridizován s vazbou oligonukleotidu na b'-straně polymorfního místa (obrázek 4.13). Po hybridizaci se k reakční směsi přidá DNA polymeráza a jeden ze čtyř modifikovaných nukleotidů. V této reakci se používají fluorescenčně značené dideoxynukleotidy, v důsledku čehož může DNA polymeráza doplnit pouze jeden nukleotid komplementární k tomu, který se nachází v analyzované poloze. Reakce tedy probíhá pouze ve zkumavce, kde je přidán nukleotid, který je komplementární k analyzovanému. V některých případech jsou všechny čtyři nukleotidy přítomny v reakční směsi, ale značené různými barvivy. Fluorescenční analýza na čtyřech vlnových délkách umožňuje určit, který nukleotid je aktivován, a proto je analyzovaný nukleotid s ním komplementární. Protože tato metoda používá stejný princip jako v enzymatickém sekvenování DNA, často se nazývá mini-sekvenování.

Existují i jiné způsoby stanovení mutací na základě aktivity DNA polymerázy. V jednom z nich, zvaném pyrosekvenování, je každý krok prodloužení řetězce DNA polymerázy zaznamenán tvorbou pyrofosfátu, který je sledován pomocí konjugovaných enzymatických reakcí, což má za následek vypuknutí chemiluminiscence v reakci na tvorbu pyrofosfátu (Obrázek 4.14). Tato metoda umožňuje sekvenování pouze velmi krátkých úseků DNA, takže jejím hlavním použitím je analýza mutací. Nukleotid, který má být analyzován, je identifikován přidáním kterého ze čtyř nukleotidů (konvenční nukleotidy jsou použity v této metodě) vedly k vypuknutí chemiluminiscence.

Obr. 4.13. Mini-sekvenování

Obr. 4.14. Princip sekvenování DNA

DETEKCE MUTACE IA DIAGNOSTIKA Pokud jsou správně používány, detekční metody určují přítomnost nebo nepřítomnost mutací s velmi vysokou citlivostí a specificitou, což umožňuje, aby informace získané těmito metodami byly použity k velmi důležitým rozhodnutím, jako je potřeba potratů během prenatální diagnostiky.

Pro prenatální diagnostiku existují dvě metody. Amniocentéza spočívá ve výběru asi 10 ml plodové vody přes břišní stěnu (obr. 4.15). Optimální termín

Obr. 4.15. Amniocentéza

provádění - 16. týden těhotenství. Fetální buňky se izolují z kapaliny odstředěním a buď se okamžitě analyzují PCR nebo se umístí do kultury. Buňky v kultuře se dělí a po určité době jsou dostačující pro provedení chromozomální analýzy a později biochemické. Druhá metoda, biopsie choriových klků, je možná v časnějších stadiích těhotenství, v týdnu 10-12 (obr. 4.16). Tento postup spočívá v transabdominální nebo transcervikální biopsii choriových klků. Chorionové buňky mohou být kultivovány nebo analyzovány okamžitě, pokud je k dispozici dostatek materiálu pro analýzu DNA. Pokud jsou zjištěny chromozomální abnormality nebo mutace, může být těhotenství přerušeno rodiči.

Provádění prenatální diagnostiky mutací má smysl, když existuje spolehlivá metoda pro detekci mutace, která je v dané rodině přítomna. V některých případech to lze určit

Obr. 4.16. Choriová biopsie

zda plod zdědil dědičné onemocnění, neznal přesné umístění mutace, ale spoléhal se na analýzu genetického spojení nemoci v rodině. To však není vždy možné, protože pro analýzu fúze jsou zapotřebí vzorky DNA od několika nemocných příbuzných a velkého počtu zdravých členů rodiny.

4.5.2. VLASTNOSTI DIAGNOSTICKÉ APLIKACE DNA

Maximální diagnostická hodnota genetického testování je pozorována v případech, kdy existuje vysoká korelace mezi přítomností genetického defektu a pravděpodobností vzniku patologie, tj. U onemocnění s vysokou penetrací.

Takové nemoci mají neustálý tlak přirozeného výběru, v důsledku čehož je jejich četnost v běžné populaci obvykle malá. V tomto ohledu je většina aplikovaných genetických testů spojena s diagnózou vzácných forem onemocnění. Dokonce i nejběžnější formy lidských monogenních onemocnění, popsané níže, se klinicky neprojevují častěji než u jedné osoby z několika set.

Běžná lidská onemocnění, jako je hypertenze, diabetes, kardiovaskulární onemocnění, ačkoli jsou závislá na genetických faktorech, mají nízkou penetraci, složitou, variabilní a špatně studovanou genetickou strukturu, a to navzdory zjevné potřebě hledat genetickou predispozici k běžným onemocněním, výsledky takových výzkum je v praxi velmi omezený.

FAKTORY ÚČINNOSTI Poměr informativnosti výsledků diagnostiky DNA a nákladů na její realizaci je do značné míry determinován genetickou komplexností onemocnění. Příklady zahrnují hemochromatózu, ve které dvě mutace způsobují téměř všechny klinické případy mezi bílou populací a familiární hypercholesterolemii, která může být způsobena více než 800 mutacemi v genu LDL receptoru, z nichž žádné nejsou častější než u 1% pacientů s familiární hypercholesterolémie. Většina dědičných onemocnění je v tomto rozsahu středně pokročilá, blíží se familiární hypercholesterolemii, kdy náklady na diagnostiku DNA mohou omezit její implementaci.

Za určitých podmínek může být snížena složitost diagnózy, a tudíž i její náklady. To je možné v populacích, ve kterých je genetická struktura onemocnění jednodušší než v jiných populacích. Tento efekt je nejvýraznější v populacích s tzv. Zakladatelským efektem. Tento genetický termín znamená, že významná část populace zdědila určitou mutaci od jednoho ze svých předků. Vzhledem k této čistě náhodné události v této populaci je většina případů tohoto onemocnění způsobena touto mutací. Typický příklad příbuzný genetickému testování je populace Afrikánců, obyvatelé jižní Afriky severoevropského původu. Moderní Afrikánci jsou potomky malého počtu rodin z Holandska, kteří v 17. - 18. století migrovali do Afriky. Mezi Afrikánci je familiární hypercholesterolemie, vedoucí k časnému rozvoji ischemické choroby srdeční, několikanásobně častější než u evropské nebo americké populace. Navíc, drtivá většina (> 95%) případů familiární hypercholesterolemie v jihoafrické bílé populaci je způsobena přítomností jedné ze tří mutací v LDL receptoru. Taková genetická homogenita kontrastuje ostře s genetickou strukturou familiární hypercholesterolémie v jiných zemích, kde jsou popsány stovky mutací, z nichž žádná není častější než u 1-2% pacientů. Zdá se, že několik rodin přistěhovalců (nejméně tři) mělo mutace, nyní nazývané afrikanerskimi, které se staly hlavní příčinou familiární hypercholesterolemie v jejich potomcích. Z hlediska praktické medicíny je molekulárně genetické testování bílých lidí v Jižní Africe na přítomnost familiární hypercholesterolemie poměrně účinným a relativně nenákladným přístupem, který umožňuje presymptomatickou diagnostiku tohoto onemocnění. Na rozdíl od Jihoafrické republiky vyžadují další země mnohem dražší arzenál molekulárních metod, aby takovou diagnózu učinily.

U jiných dědičných onemocnění je také rozdíl ve frekvenci mutací mezi populacemi. Například mutace cis₂₈₂

Pneumatika v genu HFE, vedoucí k rozvoji hemochromatózy, je poměrně běžná u evropských populací, kde frekvence jejich nosičů je až 10-15%. Naproti tomu v afrických, asijských a australských domorodých populacích

Tato mutace je velmi vzácná. Předpokládá se mutace Cis₂₈₂-Pneumatika vznikla v Evropě asi před 2000 lety.

Kromě zakladatelského efektu je druhým biologickým mechanismem, který zjednodušuje hledání mutací i v geneticky otevřené populaci, přítomnost horkých mutačních bodů v genech. Je prokázáno, že pravděpodobnost výskytu mutací se liší v oblastech genomu s různým obsahem GC-nukleotidů. Také je známa sekvence, ve které je DNA polymeráza a zastavena; v takových oblastech se sporadické delece často nacházejí v různých genech. Vzhledem k těmto faktorům nejsou mutace rozloženy rovnoměrně po délce genu, ale jsou soustředěny v určitých oblastech, což zjednodušuje jejich vyhledávání.

Pro účinnou diagnostiku DNA jsou tedy potřebné informace o nejčastějších mutacích vedoucích k rozvoji tohoto onemocnění v populaci, do které pacient náleží.

FAKTORY DIAGNOSTICKÉ HODNOTY

U řady dědičných metabolických poruch může být během biochemické analýzy podezření na přítomnost onemocnění. Například u pacientů s familiární hypercholesterolemií je hladina LDL cholesterolu obvykle zvýšena a při hemochromatóze se zvyšuje saturace transferinu železem. Biochemické parametry podléhají variabilitě u každého jedince. V důsledku toho se jednotlivcům, například se zvýšenými hladinami LDL cholesterolu, doporučuje opakovat testy s intervalem 3 měsíců, aby se ujistili, že zjištěná metabolická odchylka je spolehlivá. V některých případech jsou biochemické indikátory v tzv. Šedé zóně, což dále diagnózu komplikuje. Zde může pomoci diagnostika DNA. Přítomnost mutace ukazuje zprůměrovanou predispozici po celý život, aby se tento biochemický parametr posunul na patologickou stránku, abych tak řekl patologickou připravenost. Na rozdíl od biochemického fenotypu genotyp nepodléhá individuálním a populačním variacím charakteristickým pro biochemické parametry. Diagnostika DNA tak umožňuje potvrdit biochemickou diagnózu nezávislou metodou a vyloučit přítomnost jiných příčin této biochemické poruchy. Je zřejmé, že maximální informovanosti o DNA diagnóze dědičných metabolických poruch je dosaženo v kombinaci s klasickými biochemickými metodami.

Při diskusi o specifičnosti a citlivosti metod DNA diagnostiky je třeba nejprve určit, co je v sázce - určení specifické mutace nebo hledání neznámé genetické poruchy u pacienta. V případě specifické mutace, pro kterou byly vyvinuty spolehlivé metody detekce, se senzitivita a specificita detekce blíží 100%. Pro stanovení diagnostické hodnoty celkového molekulárně genetického testu je nutné vzít v úvahu citlivost detekce mutací v kombinaci s jejich penetrací.

Pozitivní diagnostická hodnota testu je do značné míry určována penetrací mutací. Například, detekce trizomie na chromozomu 21, nebo mutací specifických pro Duchenneovu svalovou dystrofii nebo Huntingtonovu chorobu, naznačuje, že tito jedinci s pravděpodobností blízkou 100% mají nebo budou dále rozvíjet odpovídající klinický syndrom. Tato vysoká pozitivní diagnostická hodnota však není typická pro všechny genetické testy. U mutací s nízkou penetrací, například u nosičů mutací hemochromatózy, nepřesahuje pravděpodobnost vzniku klinických projevů několik procent. V takových případech odhalení defektu pouze indikuje predispozici k rozvoji tohoto onemocnění, které silně závisí na přítomnosti dalších dědičných faktorů a faktorů prostředí.

Čím jednodušší a studovanější genetická struktura tohoto onemocnění, tím snadnější je detekovat mutaci a vyšší citlivost testu. Drtivá většina genetických onemocnění je bohužel způsobena širokou škálou mutací, často se vyskytujících v různých genech. V kombinaci s omezenými schopnostmi moderních molekulárních metod to snižuje citlivost molekulárně genetického testování. Například v současné době, dokonce i v nejlepších molekulárně genetických laboratořích pracujících s pacienty s familiární hypercholesterolemií, mohou být mutace detekovány pouze u poloviny pacientů s ověřenou klinickou diagnózou. Dalším příkladem je Duchenne myodystrofie. V tomto případě může být deleční choroba v dystrofinovém genu detekována pouze v 70% případů a zbytek pacientů potřebuje další histologickou analýzu svalové biopsie. V případech, kdy test není schopen zjistit všechny genetické změny, které vedou k onemocnění, je jeho negativní prediktivní síla nízká.

V určitých situacích může být negativní prediktivní síla testů DNA velmi vysoká. Jedná se o prenatální a presymptomatickou diagnostiku v případech, kdy jsou známy patogenní mutace přítomné u rodičů. V takové situaci vysoká přesnost molekulárních metod umožňuje s dostatečnou spolehlivostí ukázat nejen přítomnost, ale také absenci rodičovských mutací u plodu nebo dítěte.

Souhrnně lze říci, že většina molekulárně genetických testů má významnou pozitivní prediktivní sílu, což je vhodné použít na klinice, zejména v případě vysoké penetrace a patogenity mutací. Naopak negativní predikční síla většiny molekulárních testů je malá, s výjimkou případů, kdy je známo, které mutace byly u rodičů.

4.5.3. PŘÍKLADY POUŽITÍ DNA DIAGNOSTIKY V KLINIKU

Jak je dobře známo, klasická lékařská genetika popisuje monogenní vysoce penetrační a klinicky závažná onemocnění. Frekvence těchto onemocnění obvykle nepřesahuje 1 na 5000 obyvatel. Pomocí analýzy DNA lze detekovat asi tisíc monogenních dědičných onemocnění. Seznam testů a laboratoří, které je provádějí, je neustále aktualizován na internetu (http://www.geneclinics.org). Většina DNA diagnostiky se nyní používá v genetickém poradenství a prenatální diagnostice, aby se zabránilo narození dětí s patologií.

Kromě klasických monogenních případů se však na klinice často vyskytují dědičná onemocnění, která se vyznačují relativně nízkou penetrací a relativně mírným průběhem. Tradičně, oni byli přičítáni k monogenic, nicméně, nahromaděná data nedávno ukazují více oligogenic povahy těchto nemocí.

Následuje podrobná diskuse o několika běžných lidských oligogenních onemocněních, jako je hemochromatóza, dědičná trombofilie, familiární hypercholesterolemie, cystická fibróza a hypertrofická kardiomyopatie. Heterozygotní nositelé mutací vedoucích k těmto onemocněním se vyskytují v populaci s frekvencí 1 až 500 až 1 z 20 osob. Vzhledem k vysoké populační frekvenci onemocnění v této skupině je významný

podíl na lidské patologii, pravděpodobně převyšující přínos vzácných dědičných onemocnění. Pro všechny tyto choroby umožňuje testování DNA presymptomatickou diagnózu, hemochromatózu, trombofilii a hypercholesterolemii a následnou profylaxi, a to jak farmakologicky, tak změnou životního stylu.

Jedná se o jednu z nejčastějších genetických metabolických poruch zvaných vrozené metabolické chyby Hemochromatóza (GC) se vyskytuje u 1 z 200-300 lidí v severní Evropě.

Klasická triáda - diabetes, cirhóza a pigmentace kůže ("bronzový diabetes") - byla popsána již v roce 1865 a v roce 1935 byla prokázána rodinná povaha tohoto onemocnění. Základem klinických projevů GC je biochemický defekt - nadměrná akumulace železa v parenchymálních buňkách jater, slinivky, srdce a přední hypofýzy. Aby se zabránilo rozvoji klinických projevů, můžete použít velmi jednoduchý a zároveň efektivní způsob - preventivní flebotomii. Mezilehlý fenotyp GC je zvýšená hladina železa v plazmě a játrech, která je hodnocena různými biochemickými testy, jako je saturace transferinu železem, koncentrace feritinu a obsah železa v játrech.

Klinické projevy GC jsou velmi rozdílné. Jedním z nejčastějších projevů je chronické poškození jaterních parenchymů. Charakteristickým rysem je všeobecné nebo lokální zesílení pigmentace kůže. 30-60% pacientů s pokročilým onemocněním má diabetes. V raných stadiích GC se projevují nespecifické symptomy, jako je letargie, hepatomegalie, artropatie, kardiomyopatie, diabetes, hyperpigmentace kůže nebo hypogonadismus. Klinické projevy závisí na genetických a vnějších faktorech, jako je obsah železa ve stravě, dárcovství krve a fyziologická ztráta krve u žen během menstruace.

V roce 1996 byl identifikován gen, který byl zodpovědný za nejběžnější formu GC, která se nazývala HFE. Tento gen kóduje transmembránový protein sestávající z krátké cytoplazmatické domény, transmembránové oblasti a tří extracelulárních domén, které interagují s p₂-mikroglobulin na povrchu buněk. Protein HFE se váže na povrchu enterocytů k receptoru transferinu a snižuje afinitu k přenosu transferinu.

železo V nepřítomnosti funkčně aktivního HFE vzrůstá vazba a následná endocytóza transferinu, což vede k hromadění železa uvnitř buňky, kde je uložen jako komplex s feritinem. U pacientů s keltským původem s klinicky těžkou GC je asi 90% homozygotních pro mutaci Cis₂₈₂-Pneumatika v genu HFE a většina zbývajících má kombinaci Cys₂₈₂-Tyr a další mutace - GiS_bz-Asp. V důsledku mutace Cis₂₈₂-Tyr narušuje tvorbu disulfidové vazby v jedné z extracelulárních domén proteinu HFE, jeho konformace je narušena a protein zůstává po syntéze v endoplazmatickém retikulu. V důsledku toho protein přestává být exprimován na buněčném povrchu, což vede ke zvýšenému zachycení železa, které je nedostatečné pro potřeby organismu. Ve většině populací Caucasoid je frekvence heterozygotních nosičů alely Cis₂₈₂-Rozsah je asi 10%, a pro Basky a irské lidi keltského původu, frekvence tohoto polymorfismu může dosáhnout 30%. Na rozdíl od Evropanů se tato mutace v Mongoloidech a negroidech téměř nikdy nenachází. Předpokládá se mutace Cis₂₈₂-Pneumatika vznikla asi před 2000 lety v keltské populaci a rozšířila se po celé Evropě kvůli migraci populace, tj. Příčinou vysoké četnosti této mutace je zakladatelský efekt.

Existují i další nemoci s klinickým obrazem připomínajícím klasickou rodinu GC (také klasifikovanou jako typ 1 GC), ale s jiným původem. Juvenilní GC (typ 2), stejně jako typ 1 GC, se dědí autosomálně recesivním způsobem a je způsoben mutacemi v neznámém genu. Typ 3 GC je také recesivní onemocnění a je spojen s mutací v receptoru transferinu. GC 4. a 5. typu jsou dědičně dominantní a jsou způsobeny mutacemi genů ferroportinu, transportem železa ve střevě a feritinu. Všechny tyto formy jsou velmi vzácné a jejich definice dnes nehraje praktickou roli.

Pneumatika v genu HFE je charakterizována vysokou penetrací vzhledem k intermediárnímu fenotypu, tj. Biochemickému projevu nadbytku železa v těle. 95% mužů starších 40 let, kteří jsou homozygotní pro tuto mutaci, má přebytek železa a existují klinické příznaky a symptomy. Předčasné ženy mají nižší riziko v důsledku ztráty krve během léčby

menstruace. Fenotypový účinek mutace GiS_bz-Asp je méně výrazný. Fibróza nebo cirhóza jater je detekována analýzou biopsie u 4-25% homozygotních nosičů alely Cis₂₈₂

Střelnice Kromě toho, alely Cis₂₈₂-Tir predisponuje k rozvoji hepatocelulárního karcinomu. U mužů s GC a cirhózou je relativní riziko vzniku hepatocelulárního karcinomu 200krát vyšší.

ZKOUŠENÍ MÉDIÍ

Přítomnost výše uvedených příznaků je indikací pro genetické testování na GC. Diagnóza je však prováděna během rozšířeného klinického obrazu, kdy je příliš pozdě na provedení prevence primárního defektu. V tomto ohledu mnozí výzkumníci obhajují potřebu screeningu populace na přítomnost GC. Toto onemocnění splňuje mnoho požadavků na nemoci, které se podrobují screeningu, tj. vyskytuje se poměrně často, má latentní fázi, která předchází klinickým projevům, je snadno diagnostikována biochemickými a genetickými metodami a lze jí zabránit pomocí účinné a levné léčby.

V současné době je však masový screening považován za předčasný vzhledem k nejednoznačnostem, které se týkají především pronikání GC. Určitě se doporučuje testovat příbuzné pacientů s GC, kteří by měli měřit úroveň saturace transferinu železem, obsah feritinu a biochemické markery jaterní dysfunkce, stejně jako zjistit přítomnost mutací v genu HFE pomocí poloh 282 a 63.

Z technického hlediska není detekce těchto mutací obtížná. Obvykle se používá restrikční analýza nebo různé formy alelicky specifické amplifikace nebo hybridizace.

4.5.3.2. Dědičná trombofilie

Trombofilie - tendence k rozvoji trombózy spojené s vrozenými a získanými poruchami srážlivosti krve a fibrinolýzou. Trombofilie se nejčastěji vyskytuje jako žilní trombóza a tromboembolie, které se vyskytují při frekvenci přibližně 1 na 1000 obyvatel za rok.

Existují familiární formy trombofilie, popsané již v 50. letech. První identifikované příčiny dědičné trombofilie (NTF) byly deficience antitrombinu III,

protein C a jeho proteinový kofaktor S. Později byly identifikovány další dvě formy NTF - mutace koagulace faktoru V, která způsobuje rezistenci faktoru V na aktivovaný protein C a mutaci v genu prothrombinu G20210A, což zvyšuje hladinu protrombinu v plazmě. Mírná hyperhomocysteinemie, často spojená s rozšířeným polymorfismem v genu MTHFR, je také rizikovým faktorem pro venózní trombózu.

THROMBOEMBOLICKÁ KOMPLIKACE Závažnost klinických projevů NTF se velmi liší. Často postupují ve velmi mírné formě a jejich přítomnost může být stanovena pouze laboratorními metodami. V mnoha případech se však u nosičů mutací vyvine hluboká žilní trombóza dolních končetin, plicní tromboembolismus, povrchová tromboflebitida a také žilní trombózy jiné lokalizace. Tyto dědičné defekty obvykle nejsou spojeny s rizikem arteriální okluze. NTF předurčují k rozvoji trombózy v mladém věku: až 40% pacientů mladších 45 let s nevyprovokovanou hlubokou žilní trombózou má jednu z forem NTF. U starších pacientů nebo v přítomnosti provokujících faktorů NTF bylo pozorováno u 30% případů trombózy. U pacientů s kombinací dědičných defektů se riziko tromboembolických komplikací dále zvyšuje.

Dědičný nedostatek antitrombinu III a proteinů C a S se vyskytuje celkem u méně než 1% populace, ale u pacientů s venózním tromboembolismem (VTE) se vyskytuje v téměř 10% případů. Riziko VTE u těchto pacientů je 5-8krát vyšší než u běžné populace. Důvodem nedostatku těchto přírodních antikoagulancií může být snížení jejich syntézy nebo (častěji) snížení funkční aktivity proteinu při zachování normální hladiny. Defekty syntézy nebo funkce proteinu jsou způsobeny stovkami různých mutací v těchto genech.

Dědičná rezistence vůči aktivovanému proteinu C je nejčastější příčinou NTF. Ve více než 95% případů je rezistence způsobena mutací missense v genu Faktor V, který se nazývá Leydenův gen, ve kterém je v poloze 506 arginin nahrazen glutaminem. Tento aminokyselinový zbytek normálně způsobuje proteolytické štěpení faktoru V aktivovaným proteinem C. Protein C je přírodní antikoagulant, který je aktivován trombin-trombomodulinem.

komplex na endotelových buňkách a ničí faktory V_a a viii_a, vedoucí k zastavení tvorby trombu. Tento proces je významně urychlen v přítomnosti proteinu S, který působí jako proteinový kofaktor C. Pokud existuje aminokyselinová substituce v faktoru Va Arg₅₀₆-Gin aktivovaný protein C ho nemůže rozbít, což vede k zachování aktivity faktoru Vа a zvýšení tvorby trombu (obr. 4.17).

Leidenská mutace se vyskytuje téměř výhradně mezi bělochy, ve kterých je asi 5% populace nositeli. Vzhledem k vysoké frekvenci této genetické formy v obecné populaci by se však mělo odkazovat na polymorfismus

Obr. 4.17. Rezistence na aktivovaný protein C, způsobená Leidenovou mutací.

v literatuře byl název mutace stanoven. U pacientů s VTE je frekvence této mutace vyšší a je přibližně 20%. Riziko VTE u nosičů Leidenovy mutace závisí na dávce genu: u heterozygotů se zvyšuje 2-7 krát a u homozygotů 40-80 krát. Celková pravděpodobnost vzniku tromboembolie během života nosičů této mutace je 30%.

Polymorfní alela G20210A v 3'-netranslatované oblasti protrombinového genu v obecné populaci se vyskytuje s frekvencí 2%, ale u pacientů s VTE se podíl nosičů polymorfismu zvyšuje na 7%. Přítomnost polymorfismu G20210A v prothrombinovém genu tedy zvyšuje riziko VTE přibližně třikrát. Patologickým účinkem tohoto polymorfismu je zvýšení aktivity protrombinu v plazmě. Hladina protrombinu v AA homozygotech je 1,5 krát vyšší než u homozygotů v normální GG alele, která přispívá k trombóze. Zdá se, že mutace G → A označuje typ mutací se získáním funkce, protože zvyšuje účinnost zpracování 3'-konce mRNA, což vede k akumulaci mRNA a zvýšení syntézy proteinu protrombinu.

Dalším predisponujícím faktorem trombózy je zvýšená hladina homocysteinu, aminokyseliny vytvořené během metabolismu methioninu. Mírné zvýšení homocysteinu zvyšuje riziko arteriální a venózní trombózy. Důvodem zvýšení může být buď abnormální dieta (nedostatek pyridoxinu, kobalamin, folát), nebo genetické faktory, jako je polymorfismus Al.₆₇₇

Šachta v genu methylenetetrahydrofolát reduktáza - enzym, který hraje důležitou roli při určování hladiny homocysteinu v plazmě. Aktivita této varianty enzymu je pouze asi 1/3 normálu. Přibližně 10% bělochů jsou heterozygotními nosiči tohoto polymorfismu. Frekvence VTE v izolovaných nosičích tohoto polymorfismu se neliší od normálu, ale řada dat ukazuje, že polymorfismus C677T přispívá k manifestaci jiných NTF.

BEREMENALITA A OBSTETRICKÁ PATOLOGIE Během těhotenství se zvyšuje hladina koagulačních faktorů závislých na vitaminu K, klesá obsah proteinu S a inhibuje se fibrinolýza. Tyto změny jsou fyziologicky proveditelné, protože jsou zaměřeny na snížení krevních ztrát během porodu, ale také zvyšují pravděpodobnost VTE během těhotenství (2,5 krát) a zejména v období po porodu (20krát).

V přítomnosti NTF je tato pravděpodobnost ještě vyšší a může dosáhnout 100-násobku u homozygotů pro Leidenovu mutaci faktoru V. Většina (až 60%) žen s VTE, která se vyvinula během těhotenství, má Leidenovu mutaci.

Kromě venózního tromboembolismu přispívají NTF k rozvoji porodnické patologie. Porušení úplné placentární cirkulace dělohy v důsledku trombózy může vést k různým komplikacím těhotenství, jako je potrat, porod mrtvého plodu, placentární abrupce, preeklampsie a intrauterinní retardace růstu. Četné studie prokázaly zvýšený výskyt NTF u pacientů s těmito komplikacemi. Existují také důkazy o tom, že přítomnost mutace nejen u matky, ale také u plodu může dále zvyšovat riziko trombózy a infarktu placenty, což vede ke ztrátě plodu. Relativní riziko komplikací těhotenství u heterozygotních nosičů mutace Leiden nebo polymorfismu protrombinového genu G20210A podle různých studií vzrostlo v průměru o 2-3 krát.

Přijetí perorálních kontraceptiv také přispívá k rozvoji VTE. Tento efekt se zvětšuje u žen s NTF. Riziko vzniku VTE u nosičů Leidenovy mutace užívajících perorální antikoncepci se podle různých odhadů zvyšuje o 20-65krát. V přítomnosti protrombinu G20210A je riziko VTE mírně nižší, ale také významně převyšuje normální hodnotu. Na základě těchto pozorování se doporučuje nepoužívat perorální antikoncepci u žen s nedostatkem přirozených antikoagulancií, homozygotů pro Leydenovu mutaci a v přítomnosti kombinovaných defektů.

Hormonální substituční terapie po menopauze je dalším iatrogenním stavem s 2-4násobným zvýšením rizika VTE. V přítomnosti Leidenovy mutace se relativní riziko může zvýšit až 15krát a frekvence opakované trombózy se také zvyšuje. V tomto ohledu se doporučuje, aby nositelé NTF, kteří měli epizody VTE, nepoužívali hormonální substituční léčbu.

INDIKACE GENETICKÉ ANALÝZY Analýza Leidenovy mutace a polymorfismu protrombinu G20210A, stejně jako stanovení deficitu antitrombinu a proteinů C a S, je účinným způsobem identifikace jedinců se zvýšeným rizikem trombotických stavů. Detekce těchto mutací umožňuje nositelům provádět profylaktickou antikoagulační terapii.

Vzhledem k nízké absolutní četnosti VTE není masový screening populace na přítomnost NTF oprávněný. Pro přítomnost NTF se považuje za vhodnější zkoumat následující skupiny pacientů: t

• osoby s VTE bez ohledu na věk a závažnost projevů;

• ženy s jedním nebo více spontánními potraty v pozdním stádiu nebo se dvěma nebo více potraty;

• těhotné ženy s intrauterinní retardací růstu nebo s placentárním porušením;

• příbuzní prvního stupně příbuznosti pacienta s NTF v historii;

• ženy s rodinnou anamnézou NTF před použitím perorální antikoncepce, hormonální substituční terapie nebo těhotenství.

DIAGNOSTICKÉ ZKOUŠKY Mezi testy s vysokou prioritou pro přítomnost NTF patří:

• stanovení aktivity antitrombinu (amidolytická metoda);

• stanovení aktivity proteinu C (koagulometrická nebo amidolytická metoda);

• stanovení koncentrace proteinu S (celkové a volné frakce antigenu);

• koagulometrické stanovení rezistence vůči aktivovanému proteinu C;

• stanovení Leidenovy mutace faktoru V;

• stanovení polymorfismu protrombinu G20210A;

• stanovení plazmatických hladin homocysteinu.

Jak je patrné z výše uvedeného seznamu, deficience antitrombinu a proteinů C a S se stanoví funkčními metodami. To je dáno tím, že tyto defekty jsou způsobeny velkým počtem mutací a jejich identifikace vyžaduje velké úsilí a náklady, zatímco funkční analýzy jsou jednoduché a spolehlivé.

Analýza Leidenovy mutace a polymorfismu protrombinu je jednoduchá a dobře doplňuje funkční testy. Zdá se, že analýza polymorfismu C677T v genu pro methylen tetragid rofolatreduktázu nemá samostatnou diagnostickou hodnotu a měla by být použita v kombinaci s biochemickým stanovením koncentrace homocysteinu v plazmě. Použití této sady testů umožňuje detekci dědičného defektu koagulačních faktorů nebo zvýšení homocysteinu u přibližně 40% pacientů s VTE.

Nejspolehlivější metodou pro identifikaci Leidenovy mutace a protrombinu G20210A je restrikční analýza, ale široce se používá také alelicky specifická PCR a hybridizace.

4.5.3.3. Familiární hypercholesterolémie

Familiární hypercholesterolemie (FHC) je zřejmě nejčastějším autosomálně dominantním lidským onemocněním. Frekvence FHD ve většině populací je 1 v 500. V populacích se zakladatelským efektem jsou heterozygotní formy mnohem běžnější: 1 z 70 v Afrikánců v Jižní Africe a 1 z 200 v Kanaďanech francouzského původu. Ze stejného důvodu se zvyšuje frekvence FHD u Finů, Druze a Libanonců.

Ne všechny případy FHC jsou klinicky diagnostikovány. Například, v Rusku, méně než 1% pacientů s FHCS dalo klinickou diagnózu a nejúčinnější diagnóza (přes 40% identifikovaných nosičů) se provádí na Islandu kvůli malé velikosti populace s výrazným zakladatelským efektem a malou variabilitou mutability.

Hlavními diagnostickými rysy SGHS jsou zvýšený cholesterol v krvi, přítomnost šlachových xantomů u pacienta nebo příbuzných prvního stupně a dominantní model dědičnosti zvýšeného cholesterolu nebo ischemické choroby srdeční.

Klinicky se SGHS projevuje zvýšeným rizikem aterosklerózy a jejích komplikací. Mechanismy spojující zvýšení cholesterolu s rozvojem ischemické choroby srdeční nejsou plně známy. Předpokládá se, že vysoká hladina LDL bohatého na cholesterol přispívá k jejich pronikání do stěny cévy, kde oxiduje a spouští řetězec buněčných reakcí vedoucích k hromadění lipidů a lokální reorganizaci cévní stěny, což vede k aterosklerotickému plátu. V případě FHC se riziko úmrtí na infarkt myokardu v mladém věku - až 40 let - zvyšuje 100krát. U neléčených mužů s FHD ve věku 60 let je pravděpodobnost CHD asi 75%. Podle některých odhadů žije jen polovina mužů s SGHS 60 let. Průměrný věk nástupu ICHS je u mužů 40-45 let au žen je o 10 let starší. U pacientů s FHD se tedy onemocnění koronárních tepen vyvíjí o 10–20 let dříve než průměr populace.

Statiny a další léky snižující lipidy jsou účinně používány ke snížení hladin lipoproteinů v plazmě u SHHS.

Nejtěžší pacienti (zpravidla jde o homozygotní případy) jsou léčeni odstraněním nadbytku LDL výměnou plazmy. Někdy se používá transplantace jater.

BIOCHEMICKÉ A GENETICKÉ MECHANISMY

Když je SGHS cholesterol zvýšen v důsledku zvýšení plazmatického LDL. Tato metabolická porucha je spojena se snížením clearance LDL játry v důsledku snížení exprese nebo aktivity buněčných receptorů zprostředkujících příjem LDL částic (LDL receptorů). Aktivita LDL receptoru v FHCS se snižuje na všech buňkách exprimujících tento receptor, nicméně funkční důsledky jsou spojeny hlavně s defektem receptoru v játrech, protože porušení konverze cholesterolu na žlučové kyseliny vede ke snížení jeho vylučování střevy. Podobné biochemické abnormality jsou pozorovány s mutační změnou v proteinu apoB-100, což je ligand pro LDL receptor. V důsledku této mutace již LDL receptory nerozpoznají LDL částice a akumulují se v plazmě.

Gen LDL receptoru obsahuje 18 exonů, které kódují šest funkčních domén tohoto proteinu: signální peptid, doménu vázající ligand, doménu homologní s předchůdcem epidermálního růstového faktoru, O-glykosylační místo, transmembránové a cytoplazmatické domény. Všechny známé mutace v genu LDLR jsou shromažďovány v databázi UMD-LDLR, která je přístupná přes internet. Počet přihlášek překročil 800 a stále roste. Podle databáze UMD-LDLR představují substituce s jedním nukleotidem 90% všech mutací v genu LDLR, většina z nich jsou mutace s chybou a nonsense. Zbývajících 10% jsou převážně makrotransformace způsobené nerovnoměrnou rekombinací s více než 30 kopiemi Alu sekvencí přítomných v tomto genu. V promotoru bylo nalezeno méně než 10 mutací.

Ačkoli SGHS je monogenní onemocnění, fenotypová exprese, a to závažnost ICHS, se velmi liší i mezi pacienty nesoucími stejné mutace. Někteří pacienti žijí do 80 let a starší, zatímco jiní umírají na infarkt po 20 letech. Faktory ovlivňující klinické projevy mohou být vnější, metabolické a genetické.

Z environmentálních faktorů hrají zvláštní roli kouření a stravovací návyky. Kouření je jedním z nejsilnějších prediktorů úmrtnosti na ischemickou chorobu srdeční u pacientů s FHD. Úloha stravy ve vývoji

FHCS bylo prokázáno porovnáním pacientů čínského původu žijících v Kanadě s nosiči stejných mutací, ale žijících v Číně.

Kanadští Číňané mají LDL cholesterol o 70% vyšší než v Číně. 6 z 16 heterozygotů žijících v Kanadě mělo xanthomy a 4 CHD. Žádný z 18 dotazovaných žijících v Číně neměl xantom nebo ischemickou chorobu srdeční. Tyto rozdíly v klinických projevech jsou zjevně spojeny s rozdílnou konzumací nenasycených tuků. Tento příklad živě ilustruje modifikující účinek vnějších faktorů, jako je dieta, na fenotyp heterozygotních SHKS.

Průběh onemocnění silně závisí na typu mutace způsobující hyperlipidemii. Nejzávažnější hypercholesterolemie se vyvíjí v přítomnosti nulových mutací, což vede k úplné absenci aktivního receptoru, zatímco mutace se zachováním parciální syntézy nebo aktivity LDL receptorů obvykle způsobují mírnější onemocnění.

Existuje celá řada biochemických parametrů, které modifikují vývoj onemocnění koronárních tepen u pacientů s SHHS. Tyto metabolické faktory jsou: HDL cholesterol, C-reaktivní protein a fibrinogen. Některé z těchto faktorů, jako je HDL-cholesterol a lipoprotein Lp (a), mají výrazný genetický základ. Mezi další osvědčené nebo podezřelé genetické faktory patří mutace v lipoproteinovém lipázovém genu - izoformy apolipoproteinu E, připraví varianty proteinového esteru cholesterolu, polymorfismus paraoxonázy (polymorfismus enzymu lipidového peroxidu), specifický genotyp methylen tetrahydrofolát reduktázy (spojený se zvýšenou hladinou homocysteinu). a mikrosomální triglycerid nesoucí protein, ovlivňující sekreci VLDL.

Geneticky jsou mutace LDL receptoru hlavním faktorem určujícím vývoj FHC. Příspěvek jiných genů je nepopiratelný, nicméně vzhledem k relativně malému počtu pacientů s identifikovanými mutacemi LDL receptorů jsou nutné další studie modifikujících genů. V ideálním případě stanovení genotypu pacienta těmito dalšími geny umožní určit stupeň rizika onemocnění koronárních tepen a dalších komplikací u nosičů určité mutace v LDL receptoru nebo genu apoB-100.

Individuální úroveň cholesterolu podléhá přirozeným změnám, takže na základě jednoho měření cholesterolu nelze učinit žádný závěr

o dostupnosti SGHS. Navíc hladina cholesterolu závisí na věku, pohlaví a liší se v různých populacích. Hladina cholesterolu u FHCS často převyšuje průměrnou hladinu v běžné populaci, proto není možné v některých případech stanovit diagnózu pouze na základě výsledků měření plazmatického cholesterolu.

V současné době je detekce mutací v LDL receptoru nebo genu apoB-100 běžným kritériem v diagnostice FHC. Mutace na 3500. nukleotidu v genu apoB-100 (defekt rodiny apoB) je nejčastější příčinou FHC ve většině populací. V Evropě a zemích, kde žijí lidé z Evropy (Austrálie, USA, Kanada a Nový Zéland), je tato mutace způsobena u 3-5% pacientů s FHCS. V zemích se složitou genetickou strukturou onemocnění lze mutace nalézt u 30–50% pacientů s klinickou diagnózou SGHS. Je to dáno jednak nedostatečnou citlivostí screeningových metod, jednak nesprávnou diagnózou stanovenou na základě hladiny cholesterolu a klinických projevů. Existuje také možnost existence dalších genů, kromě LDLR a APOB, mutací, ve kterých je doprovázen podobný klinický obraz.

V řadě populací je DNA diagnostika SGHS významně zjednodušena díky přítomnosti omezeného počtu mutantních alel.

Ve většině geneticky otevřených populací, k nimž patří Rusko, se však častěji než u 1% pacientů s FHC nenachází žádná jediná mutace v genu LDL receptoru, obvykle méně často. V tomto ohledu hrají hlavní úlohu při diagnostice DNA FHCS screeningové metody pro vyhledávání mutací, jako je stanovení polymorfismu konformace jednovláknové DNA, následované potvrzením sekvenováním.

4.5.3.4. Cystická fibróza

Cystická fibróza (CF) je jednou z nejčastějších a současně závažných autosomálně recesivních onemocnění u lidí. Mezi Evropany je nosná frekvence okolo

1 až 50, a klinické formy se vyskytují v závislosti na regionu s frekvencí 1 až 2-3 tisíc lidí.

CF dostal své jméno podle povahy mikroskopických změn pozorovaných u slinivky břišní u těchto pacientů. Onemocnění postihuje také plíce, játra, tenké střevo a mužský reprodukční systém. Klíčovou roli v patogenezi hraje nadměrná sekrece hlenu epitelem těchto orgánů, což vede k obstrukci průdušek nebo vylučovacích kanálků jater a slinivky břišní. I přes výrazné zlepšení symptomatické léčby pacienti s CF obvykle nežijí déle než 20-30 let. Hlavní příčinou úmrtí je poškození plic způsobené blokádou průdušek, což vytváří příznivé prostředí pro sekundární infekce. Chronické infekce a zánětlivá reakce vedou k fibróze plicní tkáně, která v kombinaci s obstrukcí dýchacího traktu může způsobit respirační selhání. U 65% pacientů zabraňuje blokování pankreatických kanálků vylučování trávicích enzymů do střeva, což vede k poruchám trávení. Podobně, porušení sekrece žluči játry, pozorované u 5% pacientů. Kromě těchto projevů se u 10% novorozenců rozvine obstrukce tenkého střeva, což vyžaduje chirurgický zákrok. 95% mužů s CF má neplodnost. Charakteristickým rysem CF, který je široce používán pro jeho diagnózu, je zvýšená slanost potu spojená se zhoršenou reabsorpcí C1.

epitelu lemující kanály potních žláz.

KF je způsobena mutacemi v proteinu kódovaném genem CFTR (regulátor transmembránové vodivosti cystické fibrózy). Tento gen se skládá z 27 exonů a kóduje protein s molekulovou hmotností 168 kDa, který obsahuje dvě transmembránové domény, dvě intracelulární domény vázající nukleotid a regulační doménu. Tento protein je kanálem pro C1 - ionty. Tento kanál je aktivován cAMP-dependentní protein kinázou, která fosforyluje regulační doménu. Exit C1 - z buňky začíná řetězec reakcí, které vedou k uzavření kanálů Na + a zvyšují produkci sekrece sliznic.

Nejběžnější příčinou CF je delece tří nukleotidů v 508. kodonu, což vede ke ztrátě fenylalaninu. Frekvence této mutace u pacientů s CF se pohybuje od 50% ve střední Evropě do téměř 90% na severu. Výsledkem této mutace je narušení normálního zpracování proteinu a po syntéze není transportováno do plazmatické membrány, ale je zachováno v endoplazmatickém retikulu a degradováno. Existuje však velké množství

jiné mutace poškozující tento protein; jejich počet se blíží 1000. Tyto vzácnější mutace mohou mít odlišný vliv na chloridový kanál, například částečně nebo úplně snižují syntézu proteinu, narušují jeho intracelulární transport nebo snižují funkční aktivitu kanálu. Některé z těchto mutací způsobují pouze částečný pokles syntézy nebo aktivity kanálu, což může vést k různým funkčním projevům. V případech, kdy je zachováno méně než 3% aktivity, se vyvíjí těžká CF, doprovázená lézí pankreatu. Pokud ušetříte 3-8% aktivity ovlivní plíce a slinivka je normální. Pokud je aktivita kanálu C1 8-12%, jsou pozorovány mírné formy, jako je například azoospermie u mužů. Takový jednoduchý vztah však není vždy dodržován. Predikce průběhu onemocnění je možná pouze v případě, že existuje homozygosita pro deleci fenylalaninu-508 nebo současnou přítomnost této delece a mutace G551D. V přítomnosti těchto mutací onemocnění postupuje v klasické závažné formě s lézí pankreatu. Ve většině ostatních případů je obtížné předvídat vztah mezi typem mutace a projevem onemocnění. Existuje stále více důkazů, že CF je oligogenní onemocnění a jeho fenotypové projevy závisí nejen na povaze mutace, ale také na souboru modifikujících genů přítomných v pacientovi.

CF může být téměř vždy diagnostikován v prenatálním stadiu pomocí analýzy DNA z choriových klků, buď přímo určením mutací, nebo použitím vazebné analýzy s použitím polymorfních intragenních markerů v případech, kdy mutace u nemocného dítěte nejsou známy. Problematika screeningu populace na přítomnost CF je v současné době zvažována. Akumulované informace o genetické struktuře CF nám umožnily vybrat 30 mutací z téměř 1000 známých, což však vysvětluje 90% případů CF v různých regionech Evropy a USA. Technicky je DNA diagnostika CF velmi dobře rozvinutá a pro její realizaci se vyrábí řada komerčních souprav.

4.5.3.5. Hypertrofická kardiomyopatie

Hypertrofická kardiomyopatie (HCM) je jednou z nejčastějších lidských nemocí s výraznou genetickou predispozicí. Vyskytuje se s frekvencí 1 z 500, která je významně vyšší než frekvence jiné rodinné formy kardiomyopatie - dilatované (1 v 2500). HCM je dědičné

na autozomálně dominantním typu a je charakterizován penetrací až 75%. Klinicky se onemocnění projevuje formou hypertrofie levé a / nebo pravé komory a zvýšením velikosti síní. Hypertrofie je obvykle asymetrická a ovlivňuje interventrikulární septum. Histologicky, hypertrofie a nepravidelné uspořádání kardiomyocytů, stejně jako intersticiální fibróza, jsou pozorovány ve svalovém srdci. Onemocnění vede k arytmiím a náhlé smrti, stejně jako k selhání srdce.

Příčinou onemocnění na molekulární úrovni je dysfunkce proteinů, které tvoří sarkomeru, takže hcmp se někdy nazývá sarkomere. Hypertrofie je kompenzační odezva myokardu na pokles kontraktility. V současné době bylo identifikováno 11 genů, mutace, které vedou k hcmp (Tabulka 4.11).

Mutace sarkomerických proteinů mají odlišný vliv na kontraktilní funkci kardiomyocytů. Výsledkem je, že missense mutace často tvoří stabilní, ale neaktivní proteiny, které jsou vloženy do sarkomeru a narušují jeho funkci, tj. dominantní negativní účinek. Naopak mutace

Tabulka 4.11. Mutace vedoucí k hypertrofické kardiomyopatii

s posunem v rámu vedou k tvorbě inaktivních zkrácených proteinů, které podléhají zrychlené degradaci. V obou případech klesá kontraktilní aktivita a vyvíjí se kompenzační hypertrofická reakce.

Typ mutace může ovlivnit závažnost onemocnění. Například vysoké riziko náhlé srdeční smrti je spojeno s mutacemi v genu MYH7 Arg_4oz-Gin, Arg_{45 s}-Cis a arg_{72 s}-Gly Naproti tomu mutace Gly_25b-Glu, Val₆₀₆-Met a Lei₉₀₈- Hřídel není spojen se zvýšeným rizikem arytmií. Mutace v genu MYBPC3 jsou obvykle spojeny s mírnou hypertrofií u mladých pacientů, pozdním nástupem onemocnění a relativně příznivou prognózou. Znalost typu mutace tedy nejen potvrzuje diagnózu hcmp, ale v některých případech pomáhá při stanovení prognózy.

Vzhledem k významné genetické heterogenitě představuje molekulární diagnostika hcmp určitou složitost. Kvůli různorodosti mutací se pro vyhledávání této choroby používají hlavně screeningové metody, jako je analýza polymorfismu konformace jednovláknové DNA, elektroforéza v denaturačním gradientu a také denaturační HPLC. Hledání mutací se provádí hlavně v genu pro těžké řetězce β-myosinu, stejně jako v genech srdečního troponinu T a proteinu C vázajícího srdeční myosin.

Biochemická diagnostika onemocnění jater. Stručná informace o struktuře jater.

Biochemická diagnostika onemocnění

Dekódování biochemické analýzy krve

Co ukazuje biochemické vyšetření krve?

Jaké jsou indikace biochemické analýzy krve?

Jak udělat krevní test pro biochemii?

Normy biochemické analýzy krve (tabulka)

Jak rozluštit biochemickou analýzu?

Celkový protein

Bilirubin

Enzymy

Kyselina močová

Kolik je biochemický krevní test?

Biochemie a patobiochemie jater. Biochemická diagnostika onemocnění jater

Biochemická diagnostika onemocnění

KAPITOLA 4 BIOCHEMICKÁ DIAGNOSTIKA PATOLOGICKÝCH PROCESŮ A HEREDITÁRNÍCH CHOROB t

Přečtěte Si O Čištění Játra

Populární Kategorie

Cysta Jater

Rakoviny Jater